1、目的：細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化與心肌缺血-再灌注損傷(IRI)和缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)密切相關(guān)。心肌缺血早期發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高是IPC必不可少的觸發(fā)因素，而維持胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)是IPC保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。心肌肌漿網(wǎng)鈣-ATP酶(SERCA2a)在心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控中起主要作用，對(duì)SERCA2a在IPC過(guò)程中基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究有可能從基因表達(dá)調(diào)控層面揭示SERCA2a在IPC中的作用和機(jī)制。藥物誘導(dǎo)預(yù)適應(yīng)作為IPC研究的一個(gè)重要內(nèi)容，具有

2、明確的臨床應(yīng)用前景，日益受到重視。故在實(shí)驗(yàn)中我們還探討了前胡丙素誘導(dǎo)預(yù)適應(yīng)的可能作用機(jī)制。 方法：1．從大鼠心肌組織中提取基因組DNA作為。PCR 反應(yīng)模板2．設(shè)計(jì)并合成合適的引物，用PCR法獲得大鼠SERCA2a啟動(dòng)子基因片段3．用pGEM-T easy載體連接獲得的啟動(dòng)子片段，用以轉(zhuǎn)化E．coli Competent Cell JMl09以大量擴(kuò)增目的片段并送測(cè)序鑒定4．選擇合適的核酸內(nèi)切酶剪切SERCA2a啟動(dòng)子片段，插入

3、到pGL<,3>-Basic載體中構(gòu)建成熒光素酶報(bào)道基因質(zhì)粒5．參照美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版的《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》上方法進(jìn)行新生大鼠心肌細(xì)胞的分離、純化和培養(yǎng)6．用將心肌細(xì)胞置于模擬缺血液中厭氧培養(yǎng)的方法模擬心肌缺血，檢測(cè)模擬缺血后LDH漏出量，摸索建立IRI和IPC等細(xì)胞模型的合適缺血時(shí)間7．用熒光素酶報(bào)道基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，分組后分別建立不同的模型8．裂解各組細(xì)胞，加入熒光素酶底物，用SHG-D生物化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x對(duì)各組細(xì)胞裂解液

4、進(jìn)行熒光分析。 結(jié)果：成功構(gòu)建了熒光素酶報(bào)道基因質(zhì)粒，熒光分析結(jié)果顯示： 1．短暫缺血組熒光素酶活性為陽(yáng)性對(duì)照組的76.68﹪；2．IRI組活性為陽(yáng)性對(duì)照組的26.82﹪；3．IPC組活性為43.13﹪；4．前胡丙素預(yù)適應(yīng)組活性為43.67﹪；5．陰性對(duì)照組6.2996。 結(jié)論： 1．SERCA2a基因的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控參與了IPC、IRI等過(guò)程，在這些過(guò)程中SERCA2a肩動(dòng)子活性受到嚴(yán)重抑制； 2

5、．SERCA2a啟動(dòng)子對(duì)模擬缺血損傷非常敏感，尚不致引起明顯細(xì)胞損傷的短暫模擬缺血即可使其活性明顯受到抑制，模擬IRI可以使其活性降至很低的水平； 3．短暫模擬缺血(預(yù)適應(yīng))本身雖然也抑制SERCA2a啟動(dòng)子的活性，但也能使SERCA2a啟動(dòng)子對(duì)其后發(fā)生的模擬IRI產(chǎn)生耐受，進(jìn)而可能使得SERCA2a在IRI中的表達(dá)相對(duì)增加，有利于防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載，保護(hù)IRI細(xì)胞； 4．前胡丙素也可以誘導(dǎo)SERCA2a啟動(dòng)子對(duì)IRI產(chǎn)