1、粘細菌是δ-分支變形菌門革蘭氏陰性細菌，細胞的多細胞行為是通過滑動運動組織和驅動細胞在固體界面完成的。利用TypeⅣ pilus(T4P)作為運動馬達在固體界面上驅動細胞進行細胞群體運動(1)。T4P介導的運動的機制是與單個細胞運動相對獨立并且利用完全不同的運動機制。T4P定位于Myxococcus xanthus細胞兩極中的極性端。Myxococcus xanthus的群體(S)運動，γ-變形菌門Pseudomonasaerugino

2、sa和β-變形菌門Neisseria meningitides，Neisseria gonorrhoeae(2，3)的twitching運動是通過T4P產生的收縮力推動細胞向前運動的。M.xanthus的TypeⅣpilus(T4P)是目前已知的最強的生物馬達，單根pilus能夠產生超過100pN的力，這個力足夠推動細胞向前運動。Myxococcus xanthus的群體(S)運動另外還需要胞外多糖(EPS)，因為胞外多糖缺失突變株中是

3、沒有S運動的。目前群體運動的模型是，當T4P伸出細胞的極性末端與胞外多糖(EPS)相互連接時，極性端的T4P收縮從而使得細胞向前運動。這里所說的胞外多糖是指細胞表面的胞外多糖或者是滑動介質表面的胞外多糖。目前，許多T4P的關鍵組分已經被鑒定出來，T4P的復合物也不斷的被發(fā)現，例如，P.aeruginosa和Neisseria是中由PilM，PilN，PilO和PilP形成的內膜復合物。對于M.xanthus T4P蛋白是以何種形式形成復

4、合物驅動群體運動仍然是一個有待研究的領域。Myxococcus xanthus提供了一個很好的研究T4P的模型，不僅是因為群體滑動運動是由T4P所驅動的，而且T4P在胞外多糖(EPS)的產生中也發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。在本論文中，粘細菌T4P蛋白通過遺傳學、酵母雙雜交和細菌雙雜交等的手段進行研究。實驗前期發(fā)現的PilB點突變，能夠在沒有pili的情況下恢復部分的EPS產生。PilB點突變恢復胞外多糖實驗來分析抑制子能否在pil基因的缺失突

5、變株中抑制胞外多糖缺失，結果暗示著T4P可能存在著整合的T4P復合物結構，這個可能的復合物結構包括外膜蛋白PilQ蛋白，內膜穿膜蛋白PilN蛋白，PilO蛋白和PilC蛋白，以及錨定在內膜的脂蛋白PilP。細胞質的PilM和PilB蛋白可能也與復合物以某種相互作用。這種結構是能夠連接內膜，周質空間和外膜的。進一步的分析發(fā)現，這種結構可以存在在pilus缺失的情況下。系統(tǒng)的酵母雙雜交對于核心的關鍵T4P蛋白組分之間的直接的相互作用進行了分

6、析，將10個關鍵組分的全序列或者是部分序列分別與酵母雙雜交的激活結構域或者結合結構域的兩個載體連接構建了一系列的融合質粒。利用酵母雙雜交系統(tǒng)的mating方法對這一系列的關鍵組分潛在的相互作用進行了大規(guī)模的篩選。酵母雙雜交結果提供了直接的相互作用證據在內膜和外膜蛋白面向細胞周質空間的區(qū)域的相互作用。發(fā)現了M.xanthus Pil蛋白間存在的相互作用:1）PilB-PilB，同時也發(fā)現了PilB的N末端與C末端的相互作用。以及PilB的

7、Walker A和Walker B中點突變對于PilB的N末端與C末端的相互作用的負影響等。2）我們發(fā)現了PilC-PilC之間的相互作用，值得注意的是，PilC的相互作用是具有其自身的特異性，簡單的PilC的N末端與C末端是不存在相互作用的。我們利用一個linker將N末端與C末端連接（不包含穿膜區(qū)域），發(fā)現PilCNlinkerCC與PilCNlinkerCC具有相互作用，另外，PilCNlinkerCC與PilCClinkerCC

8、同樣具有相互作用，結果暗示著PilC的相互作用需要N末端與C末端的同時存在。3）PilQ-PilQ，PilP-PilQ，PilP-PilO和PilO-PilN蛋白間的相互作用。外膜蛋白PilQ蛋白，內膜穿膜蛋白PilN蛋白，PilO蛋白，以及錨定在內膜的脂蛋白PilP。這四個蛋白的相互作用使得外膜PilQ蛋白能夠與內膜的T4P蛋白進行信號傳導有了可能。鑒于變形菌門中多種細菌間均存在著T4P的復合物結構，我們進一步檢測了非變形菌門中的Th

9、ermus thermophiles細菌T4P蛋白間是否存在著T4P結構復合物。通過酵母雙雜交實驗分析我們獲得了PilQ-PilQ，PilW-PilQ，PilW-PilO和PilO-PilN蛋白間的相互作用。值得注意的是，PilW與M.xanthus中PilP蛋白間不存在任何的相似性。同時，PilW-PilQ與M.xanthus中PilP-PilQ蛋白間的相互作用的作用的位點是不同的，這說明相似的蛋白間的相互作用存在T4P在非變形菌門中

10、存在，盡管在Thermus thermophiles和Myxococcus xanthusPilQ蛋白存在著顯著的序列差異性，暗示著不同的菌株間仍然存在著各自的特異性，相互作用的位點因菌株不同而有所不同。Myxococcus xanthus對于T4P的結構復合物存在著許多模型，本論文是第一次給出直接的證據證明T4P蛋白自身和蛋白間存在著相互作用。變細菌門和非變形菌們的細菌中，在沒有pilus存在的前提下仍然存在著從內膜穿過周質空間到外膜

11、的整合的復合物結構，這種復合物在EPS產生中的調節(jié)支路中的作用解釋了復合物存在的原因。
　　粘細菌大規(guī)模的細胞協(xié)同作用展現復雜的社會行為。成千上萬的細胞應答貧瘠環(huán)境通過滑動運動協(xié)同運動形成子實體，在這個過程當中營養(yǎng)細胞分化形成環(huán)境抗逆性孢子。粘細菌的多細胞行為也包括swarming，rippling和捕食(4)。M.xanthus細胞是不能夠在液體中運動的，這種陸生細菌能夠在固體的介質表面進行滑動運動。當這些細胞在液體環(huán)境中靜置培

12、養(yǎng)時，在培養(yǎng)搖瓶的壁上形成生物膜。將營養(yǎng)培養(yǎng)基替換成貧瘠培養(yǎng)基時，細胞聚集，隆起并形成子實體，M.xanthus細胞是通過胞內外的信號調控過程完成多細胞行為和生孢的過程。細胞同步的協(xié)同運動完成了預先調控的發(fā)育過程。實驗室在90年代中期發(fā)現的一株能夠耐受海水的粘細菌，Myxococcus fulvus HW-1(ATCC BAA-855)與典型的陸生菌株的社會學行為有著一定的不同。在低濃度海水條件下，其與典型的陸生菌DK1622表現類似的

13、生活模式:細胞密度依賴性，固體貧瘠培養(yǎng)基上細胞聚集形成典型的子實體，子實體內的營養(yǎng)細胞分化形成孢子。但隨著海水濃度的提高，HW-1的生長模式變化，貧瘠培養(yǎng)基中營養(yǎng)細胞不經過子實體的形成，直接形成粘孢子(5)。HW-1與M.xanthus的類似的生活模式使得我們可以對比分析來對HW-1進行深入的了解，以及HW-1相對M.xanthus差異明顯的生活模式轉變，這種獨特的轉變機制的使得HW-1可以作為研究海洋粘細菌的模式菌株。實驗室為研究HW

14、-1的這種適應性進化的機制，實驗室前期利用隨機轉座質粒對HW-1進行隨機突變獲得的300多株多細胞行為和鹽應答異常的突變株。其中存在著一株突變株引起了我們的興趣，我們命名為YLH0402。對突變株進行了社會學行為的分析發(fā)現，YLH0402突變株導致菌株由聚團生長轉變?yōu)榉稚⑸L，并且通過鈣熒光白染色實驗發(fā)現，分散生長的原因是由于其胞外基質物質的急劇減少所導致的。而貧瘠條件下的多細胞子實體結構形成能力喪失，耐鹽能力也有明顯的降低。通過Sou

15、thern blot和質粒自營救實驗我們確認的唯一的插入位點在一個Na+/H+ antiporter基因。生物信息學分析發(fā)現，插入基因與M.xanthus中相應的同源基因以及上下游基因存在著很高的同源性。在M.xanthus中相應基因的插入失活顯示著子實體形成的延遲和異常，生孢能力也有所降低。半定量的RT-PCR實驗顯示M.xanthus中插入基因與其臨近的共七個基因是共轉錄的。這個基因簇內的基因的逐個敲除對于社會性行為并沒有顯著的降低

16、，整個基因簇的敲除顯示著生長的嚴重延遲，子實體形成異常，形成的孢子數目略有降低但孢子萌發(fā)率則顯著降低，暗示著形成的孢子存在著嚴重的缺陷。實驗結果顯示著這個基因簇在維持耐鹽能力和多細胞子實體結構存在著重要的作用，暗示這個基因簇可能在HW-1環(huán)境改變導致的適應機制的轉換上發(fā)揮著重要的作用。實驗室前期微陣列技術獲得的在海水和淡水條件下HW-1中表達差異的外膜蛋白，我們對這些表達差異的外膜蛋白進行了進一步的分析，這對我們在宏觀上理解HW-1的環(huán)

17、境適應性機制的轉化機制提供了可能。HW-1中表達差異蛋白與M.xanthus的同源基因的比對發(fā)現它們存在著高度的同源性。序列的高度同源性暗示著功能的相似性，在此基礎上，我們利用基因敲除和插入的方法獲得了M.xanthus中同源基因的基因缺失突變株或者是不同差異表達基因的雙敲除突變株并進行了在海水和淡水條件下發(fā)育和運動等的性質分析，發(fā)現這些基因均在社會性行為中發(fā)揮著重要的作用，暗示著這些基因參與了HW-1細胞的環(huán)境適應性過程。微陣列技術在