1、研究背景：
　　 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在我國(guó)占全身各種惡性腫瘤的7％～8％，僅次于子宮頸癌，近年來有超過子宮頸癌的傾向，并呈逐年上升趨勢(shì)，部分大城市報(bào)告乳腺癌占女性惡性腫瘤之首位[1]。自19世紀(jì)末開始，乳腺癌（改良）根治術(shù)在控制疾病進(jìn)展、改善患者生存率方面起了不可替代的作用，但其術(shù)后并發(fā)癥多也是人們不可忽視的問題。隨著醫(yī)療設(shè)備、技術(shù)及方法的不斷改進(jìn)，保乳術(shù)逐步開展。保乳術(shù)與根治術(shù)相比，具有保全患者的生理功能、美容

2、和并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)，大大提高了患者的生活質(zhì)量，明顯改善了患者因切除器官導(dǎo)致的心理障礙問題[2]。但其局部復(fù)發(fā)率高，術(shù)后將根據(jù)條件予以放療，從而有效殺滅殘留微小病灶、減少疾病復(fù)發(fā)。全乳放療再追加瘤床的放療劑量是降低疾病復(fù)發(fā)的關(guān)鍵，可顯著提高腫瘤局控率，但可能引起心、肺損傷及上肢水腫等并發(fā)癥[3～5]。如何在提高放療效果的同時(shí)減少對(duì)正常人體組織的影響成為人們研究乳腺癌輔助治療的一項(xiàng)重要課題。近十年來，人們?cè)谀[瘤分子靶向治療方面的研究取得了很大

3、的進(jìn)展，為改善腫瘤患者的預(yù)后提供了理論基礎(chǔ)。通過干預(yù)腫瘤細(xì)胞中存在的分子靶點(diǎn)，可在提高局部放射效果的同時(shí)，降低副反應(yīng)的發(fā)生，為乳腺癌患者提高生活質(zhì)量帶來裨益。
　　 DNA聚合酶θ(POLQ)是1990年發(fā)現(xiàn)的人類第八位DNA聚合酶[6]，是DNA聚合酶A家族成員之一，具有DNA雙鏈斷裂(DSB)和DNA鏈間交聯(lián)(interstrandcrosslink，ICL)修復(fù)的重要特性。它參與了DNA損傷耐受[7]，與保持基因完整性密切

4、相關(guān)。缺乏該酶的小鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞可出現(xiàn)異常核分裂或染色體斷裂的增加[8，9]。部分正常組織細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞內(nèi)缺少該酶時(shí)，將導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)過氧化氫[10]、γ射線、爭(zhēng)光霉素[11]等外界因素反應(yīng)敏感，原因是POLQ缺失或突變的細(xì)胞染色體穩(wěn)定性差，進(jìn)而損傷或抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致腫瘤、共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥和奈梅亨染色體不穩(wěn)定綜合征等疾病的發(fā)生[9,12～14]。利用該酶的這一特點(diǎn)，Higgins等通過外源基因，干預(yù)POLQ在宮頸癌He

5、la、喉癌SQ20B和胰腺癌PSN1等細(xì)胞株中的表達(dá)，證實(shí)了沉默POLQ與增加細(xì)胞的放射敏感性有著直接的聯(lián)系[15]。增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性，可以通過較小放射劑量達(dá)到同等的放療效果，從而降低了對(duì)正常組織的損傷，以及放射線本身可能帶來的二次誘癌幾率。之后該課題組運(yùn)用回顧性分析方法，發(fā)現(xiàn)大量早期乳腺癌患者切除的腫瘤組織中POLQ過表達(dá)，并證實(shí)與患者不良臨床預(yù)后、雌激素受體陰性和腫瘤病理學(xué)分級(jí)差密切相關(guān)[16]，而后兩者經(jīng)臨床研究證實(shí)，

6、均可作為獨(dú)立因素導(dǎo)致患者預(yù)后不良[17～19]。干預(yù)POLQ的表達(dá)將可能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，降低復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn);避免腫瘤細(xì)胞或組織對(duì)輔助治療產(chǎn)生耐受，改善患者預(yù)后。
　　 Lemee通過對(duì)13個(gè)核酸DNA聚合酶基因的研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中高表達(dá)而在正常乳腺組織中非高表達(dá)的惟一基因是POLQ[20]。這提示干預(yù)POLQ在人體的表達(dá)，在可能提高乳腺腫瘤細(xì)胞放療敏感性的同時(shí)，對(duì)正常乳腺組織幾乎不產(chǎn)生影響。乳腺癌細(xì)胞對(duì)放射線殺傷具有中等敏

7、感度[21]，腫塊局部切除后會(huì)給予較高劑量放射治療。在放射線殺死乳腺腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，周圍正常組織亦遭受一定的損傷[22]。所以，提高癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，將可使療效大大提高。我們擬用蛋白印跡法(Western blot)明確POLQ在人類乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中的表達(dá)后，利用RNAi技術(shù)，將設(shè)計(jì)合理的siRNA轉(zhuǎn)染入人類乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中，使得POLQ被有效沉默。之后，用不同劑量X射線照射轉(zhuǎn)染前后的MCF-7細(xì)胞，觀察POLQ沉默

8、對(duì)該細(xì)胞株放療敏感性的影響，并進(jìn)一步探討POLQ沉默后MCF-7乳腺癌細(xì)胞株放療敏感性變化的可能機(jī)制。
　　 目的:
　　 利用RNAi沉默人類乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中POLQ蛋白的表達(dá)，之后通過體外實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞增殖能力和凋亡率的變化，以及POLQ沉默對(duì)該細(xì)胞株放射敏感性的影響，為提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性提供一條新思路。
　　 方法:
　　 1.利用蛋白印跡法檢測(cè)人類乳腺癌細(xì)胞株MCF

9、-7中POLQ蛋白的表達(dá)水平;根據(jù)POLQ基因編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)并合成小干擾RNA序列(POLQ-siRNA)，經(jīng)脂質(zhì)體LipofectarnineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染入乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中;
　　 2.熒光顯微鏡下觀察siRNA對(duì)MCF-7細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率:取貼壁良好的MCF-7細(xì)胞鋪于24孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到60～70％時(shí)，用終濃度5、10、20、40、80nmol/L的Control-siRNA-FAM和1.5、2、

10、2.5、3μl/ml的脂質(zhì)體LipofectamineTM2000交叉配制成siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，20min后加入孔內(nèi)，6～12h在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率;
　　 3.MCF-7細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和Westernblot分別從基因和蛋白水平檢測(cè)POLQ表達(dá)率的變化，明確POLQ-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)mRNA和蛋白的抑制效率;
　　 4.利用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢

11、測(cè)轉(zhuǎn)染前后MCF-7細(xì)胞克隆形成能力的變化:各組細(xì)胞于轉(zhuǎn)染6h后用胰蛋白酶消化，細(xì)胞精確計(jì)數(shù)，100個(gè)/孔接種于六孔板中，每組設(shè)三個(gè)平行對(duì)照。之后放于5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2周。當(dāng)每孔內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液。用4％多聚甲醛固定20min，0.1％結(jié)晶紫染色15min。計(jì)數(shù)＞50個(gè)細(xì)胞的克隆，計(jì)算克隆形成率(PE);
　　 5.噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后MCF-7細(xì)胞增殖能力的變化:MCF-7細(xì)胞

12、按4.5×103個(gè)/孔鋪于96孔板中，孵育24h后接受轉(zhuǎn)染。分別于轉(zhuǎn)染24、48和72h后加入MTT(5mg/ml)20μl/孔，繼續(xù)孵育4h后棄去上清液。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)溶液150μl，搖床上振蕩10min，在酶標(biāo)儀上讀取490nm波長(zhǎng)的吸光度(A)值;
　　 6.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后MCF-7細(xì)胞對(duì)放射的敏感性:MCF-7細(xì)胞按不同濃度接種于六孔板中，孵育24h后接受不同劑量X線照射，根據(jù)平板克隆形成實(shí)

13、驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線，用放射增敏比(SER)作為放射敏感性的量化指標(biāo)，觀察細(xì)胞對(duì)放射的敏感性;
　　 7.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同放射劑量下細(xì)胞周期和凋亡率的改變，探討POLQ沉默導(dǎo)致放療增敏的可能機(jī)制。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用GraphPad Prism 4 Demo軟件按單擊多靶模型擬合存活曲線。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果CT值采用均值（(x)）表示，其余計(jì)量資料

14、結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)符合正態(tài)性分布，結(jié)果顯示方差整齊，3組細(xì)胞的蛋白含量[平均吸光度(INT)x雜交信號(hào)面積(S)]和平板克隆形成率之間的的比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法，吸光度A值、3組細(xì)胞各個(gè)細(xì)胞周期不同照射劑量點(diǎn)間比較和每組不同照射劑量點(diǎn)間細(xì)胞凋亡率的比較采用單因素重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析方法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　

15、 1.以宮頸癌Hela細(xì)胞株為陽性對(duì)照，Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞株MCF-7中POLQ蛋白高表達(dá)。該蛋白在體外容易被降解為～170kDa和～100kDa的片段;
　　 2.熒光顯微鏡下顯示，終濃度分別為siRNA40nmol/L和脂質(zhì)體2.5μl/ml時(shí)，POLQ-siRNA能有效轉(zhuǎn)染入MCF-7細(xì)胞中，細(xì)胞計(jì)數(shù)法顯示其轉(zhuǎn)染效率在90％以上;
　　 3.qRT-PCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)表明，siRN

16、A轉(zhuǎn)染入MCF-7細(xì)胞后POLQ-siRNA組細(xì)胞POLQmRNA和POLQ蛋白表達(dá)量分別是空白對(duì)照組的12.158％和(32.013±0.654)％。
　　 4.轉(zhuǎn)染前后MCF-7細(xì)胞增殖能力的變化:平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示siRNA轉(zhuǎn)染入MCF-7細(xì)胞后細(xì)胞克隆形成率降低;MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力低于空白對(duì)照組(P=0.000)，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.167）;
　　 5

17、.根據(jù)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出不同X線照射劑量下的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，對(duì)存活分?jǐn)?shù)按照單擊多靶模型進(jìn)行擬合。放射生物學(xué)參數(shù)顯示，POLQ沉默組MCF-7細(xì)胞后D0、Dq值顯著降低，放射增敏比(SER)等于1.24，提示轉(zhuǎn)染POLQ-siRNA后MCF-7細(xì)胞對(duì)放射的敏感性顯著增強(qiáng)。
　　 6.細(xì)胞周期結(jié)果顯示，未照射時(shí)POLQ-siRNA組S期細(xì)胞比例低于空白對(duì)照組(P=0.001);Control-siRNA組與空白對(duì)照組比較差異無

18、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.952)。0、4和8Gy時(shí)POLQ-siRNA組G0/G1期細(xì)胞均高于空白對(duì)照組，Control-siRNA組與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著照射劑量的增加，POLQ-siRNA組、Control-siRNA與空白對(duì)照組細(xì)胞G2/M期比例均提高(P＜0.01)。在不同照射劑量下，POLQ-siRNA組細(xì)胞凋亡率均高于空白對(duì)照組，Control-siRNA組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)照射劑量由4Gy增大