1、第一部分二甲雙胍對肺腺癌細胞體外增殖的作用研究 目的：研究二甲雙胍對體外培養(yǎng)的肺腺癌細胞株的增殖、細胞周期、凋亡等方面的作用，觀察二甲雙胍與順鉑聯(lián)合使用對細胞生長的影響。 方法：以0、0.5、2、8mmol/L四種濃度的二甲雙胍分別對肺腺癌細胞株A549和NCI-H1299進行體外干預，在第0、24、48和72h，以MTT法檢測各組細胞的增殖情況。將上述各濃度的二甲雙胍與順鉑(10ug/mL)聯(lián)用后，再次檢測藥物干預不同

2、時間后細胞的活性變化。選取A549細胞株為主要研究對象，以二甲雙胍干預48h后，采用流式細胞術檢測各組細胞在細胞周期及早期凋亡率等方面的差異。 結果：(1)與對照組相比，二甲雙胍2mmol/L組和8mmol/L組細胞的增殖活性在藥物作用24h后即明顯下降，以后者的下降更為明顯；0.5mmol/L組細胞在藥物作用48h后也呈顯著的生長抑制。隨著干預時間延長，二甲雙胍對各組細胞增殖的抑制更加顯著。(2)二甲雙胍與順鉑聯(lián)合使用時，對肺

3、腺癌細胞增殖的抑制作用較單用順鉑更強；二甲雙胍的濃度越高、對細胞干預的時間越長，該抑制作用越明顯。(3)二甲雙胍干預A549細胞48h后，與對照組相比，0.5mmol/L組細胞的周期分布及早期凋亡率均無明顯變化；2mmol/L組G1期細胞所占比重顯著增高(P＜0.05)，而S期細胞比重顯著降低(P＜0.01)，細胞的早期凋亡率顯著增加(P＜0.05)：8mmol/L組G1期細胞所占比重顯著升高，S期和G2/M期細胞則相應減少，細胞的早期

4、凋亡率也明顯增高(均P＜0.01)。 結論：二甲雙胍可以使細胞周期循環(huán)阻滯于G1期，并誘導細胞的早期凋亡增加，從而有效抑制肺腺癌細胞株的體外增殖，其作用呈濃度及時間依賴性增強；二甲雙胍與順鉑共同作用可以增強對肺腺癌細胞生長的抑制作用。 第二部分 JNK/p38 MAPK-Caspase信號傳導通路在二甲雙胍誘導肺腺癌細胞凋亡中的作用研究 目的：研究二甲雙胍對A549細胞內AMPK、JNK、p38 MAPK的磷酸化

5、蛋白及Caspase家族蛋白表達水平的影響，探討JNK/p38 MAPK-Caspase信號傳導通路在二甲雙胍誘導的肺腺癌細胞凋亡中的作用。 方法：以5mmol/L的二甲雙胍對A549細胞進行體外干預，在干預的第0、15、30和60min時，分別抽提細胞總蛋白，以Westernblot技術檢測細胞內AMPK、JNK、p38 MAPK的總蛋白和磷酸化蛋白的表達：在干預后第0、12、24和48h，檢測剪切后的Caspase-3、8、

6、9活性蛋白的表達水平。選擇特異性的JNK通路阻斷劑SP600125和p38 MAPK通路阻斷劑SB202190分別對細胞進行預處理1～2h，再進行二甲雙胍(5mmol/L)干預，48h后，采用流式細胞術檢測細胞早期凋亡的情況。 結果：(1)二甲雙胍干預前后，A549細胞內AMPK、JNK和p38 MAPK的總蛋白表達強度無顯著變化。二甲雙胍干預前，細胞內上述蛋白的磷酸化蛋白及剪切后的Caspase-3、8、9的表達量極低；p-A

7、MPK、p-p38和p-JNK的表達水平在藥物干預15min后即明顯增強，至60min后明顯衰減，而相應的總蛋白則變化不明顯；Caspase-8、9活性蛋白的表達水平在藥物干預12h后明顯增強，24h后，Caspase-3的表達也出現(xiàn)增強。(2)流式細胞術檢測結果提示，SP600125和SB202190本身對A549細胞的凋亡無顯著影響；但使用這兩種抑制劑分別對細胞進行預處理后，再行二甲雙胍干預，細胞的早期凋亡率較單純二甲雙胍干預組顯著

8、降低(P＜0.05)。 結論：JNK/p38 MAPK-Caspase信號傳導通路參與了對二甲雙胍誘導的肺腺癌細胞凋亡的調控。 第三部分 GADD153在二甲雙胍誘導肺腺癌細胞凋亡中的作用研究 目的：研究二甲雙胍對肺腺癌A549細胞內GADD153基因表達的影響，探討GADD153基因在二甲雙胍誘導的肺腺癌細胞凋亡中的作用。 方法：以5mmol/L的二甲雙胍對A549細胞進行體外干預，在第0、12、24、

9、48和72h，抽提細胞總RNA，采用Realtime-PCR技術檢測各時間點A549細胞內GADD153 mRNA的相對表達量。設計并合成GADD153靶向siRNA，將其轉染入A549細胞，通過RNA干擾特異性的抑制細胞內GADD153基因及蛋白的表達。采用Realtime-PCR和Western blot技術驗證對目的基因的干擾效率。以5mmol/L的二甲雙胍干預GADD153基因干擾后的A549細胞，采用流式細胞術檢測藥物干預48

10、h后細胞的早期凋亡率。 結果：(1)二甲雙胍作用12h后，A549細胞內的GADD153 mRNA表達水平即顯著增高(P＜0.01)；隨藥物干預時間的延長，該基因的表達增高更加明顯，至72h升至最高，約為干預前的14.12倍。(2)GADD153 siRNA轉染可以有效地抑制A549細胞內GADD153基因的表達，干擾效率達86％左右。(3)流式細胞術檢測結果顯示，GADD153基因干擾對于A549細胞的早期凋亡無顯著影響；經二

11、甲雙胍干預48h后，GADD153干擾的A549細胞的早期凋亡率與未干擾的細胞相比明顯降低(P＜0.05)。 結論：GADD153基因及蛋白的表達增高可促進二甲雙胍誘導的肺腺癌細胞的凋亡。 第四部分二甲雙胍抑制肺腺癌裸鼠皮下移植瘤生長的實驗研究 目的：通過構建肺腺癌的裸鼠皮下移植瘤模型，研究二甲雙胍對于肺腺癌體內生長的影響及安全性，并探討二甲雙胍在臨床抗腫瘤治療方面的價值。 方法：將人肺腺癌細胞A549接

12、種至BALB/c-nu小鼠腋背部皮下，建立移植瘤動物模型。待移植瘤長至約100mm3左右時，選取瘤塊大小、形狀較均一的裸鼠，隨機分為3組，每組5只，以腹腔注射的方式給藥治療，每日1次，持續(xù)1個月。對照組給予PBS0.2ml/d；met40組給予二甲雙胍40mg/kg/d；met200組給予二甲雙胍200mg/kg/d。觀察藥物干預過程中裸鼠的一般情況，每4天稱量動物的體重，測量移植瘤的長短徑，以計算腫塊大小。治療結束后，頸椎脫臼法處死荷

13、瘤鼠，剝離移植瘤及肺、心、腦、肝、腎等臟器，以HE染色觀察腫瘤及各器官的形態(tài)，判定腫瘤有無遠處轉移；以免疫組化染色檢測各組移植瘤內Ki-67的表達情況；以TUEL染色原位檢測腫瘤細胞的凋亡情況。試驗重復2次。 結果：(1)以A549細胞接種于裸鼠右側腋背部皮下，成功構建了肺腺癌的裸鼠皮下移植瘤模型。在為期1個月的藥物干預過程中，各組裸鼠的一般狀態(tài)良好，無明顯異常表現(xiàn)，未見明顯藥物毒副反應。(2)在藥物干預的不同時間測量移植瘤的大

14、小，均以對照組的腫瘤體積最大，met40組其次，met200組的腫瘤體積最小。藥物干預1個月后，兩個二甲雙胍治療組的移植瘤平均體積均顯著小于對照組(P＜0.01)；以對照組為參照，40mg/kg/d和200mg/kg/d劑量的二甲雙胍腹腔注射給藥對裸鼠移植瘤生長的抑制率分別為19.81％±6.25％和40.70％±8.98％。(3)對移植瘤標本行免疫組化染色結果顯示，met40和met200組腫瘤內Ki-67抗原的陽性表達率分別為38.

15、80％±10.41％和32.85％±10.14％，均顯著低于對照組(58.18％±12.83％)(P＜0.01)。(4)TUNEL染色結果顯示，對照組腫瘤內僅可見散在的凋亡細胞(3.1±1.8個/HPF)，而met40組和met200組腫瘤內的凋亡細胞數量顯著增加(分別為13.6±3.41個/HPF和16.35±3.07個/HPF)(P＜0.01)，以后者增加更為明顯。 結論：40mg/kg/d和200mg/kg/d兩種濃度的二

16、甲雙胍均可有效的抑制肺腺癌裸鼠皮下移植瘤的生長速度，使腫瘤細胞的凋亡增多、增殖活性減弱，且不會引起明顯的毒副反應，提示二甲雙胍對于肺腺癌患者的治療具有較好的臨床應用前景。 通過上述研究，得到結論如下： 1、二甲雙胍可以通過阻滯細胞周期于G1期，并誘導細胞凋亡，從而抑制肺腺癌細胞的體外增殖；二甲雙胍與順鉑聯(lián)用可增強對肺腺癌細胞的生長抑制作用。 2、JNK/p38 MAPK--Caspase信號傳導通路參與了對二甲雙