1、抗生素濫用和不合理使用導致的細菌耐藥性已成為世界抗感染治療領域面臨的嚴峻問題之一。2014年，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization）首次在全球范圍內(nèi)收集病原菌耐藥(antibacterial resistance，ABR)情況數(shù)據(jù)，發(fā)布全球性耐藥監(jiān)測報告及指導原則[1]，其中革蘭氏陰性腸桿菌科細菌耐藥問題尤為嚴重。中國作為抗生素使用大國，細菌耐藥情況更是不容樂觀。有報道稱我國住院患者使用廣譜抗生素或聯(lián)合使用兩

2、種以上抗生素比例約為58％，大大超過國際標準[2]。世界衛(wèi)生組織2012年在中國收集的約5.5萬株臨床肺炎克雷伯桿菌中，耐碳青霉烯類抗生素耐藥菌比例為7.1％，對第三代頭孢菌素類藥物頭孢噻肟耐藥率則高達52.5％[3]。中國CHINET細菌耐藥監(jiān)測報告也顯示，腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素雖高度敏感，但總耐藥率呈逐年上升趨勢，從2006年＜1％上升到2013年≤7％。
　　革蘭氏陰性耐藥菌包括產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌（大腸埃希菌

3、、肺炎克雷伯桿菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等）和非發(fā)酵糖細菌(non-fermenters)（鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌等）。其中，肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌耐藥情況最為嚴重，伴隨著越來越多臨床多重耐藥和泛耐藥菌株的出現(xiàn)，實驗室診斷和臨床抗感染治療日益困難。
　　導致腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的碳青霉烯酶是指能夠明顯水解至少亞胺培南或者美羅培南的一類β-內(nèi)酰胺酶，按照Amber分類分為三類:A類，B類和D類。

4、其中，B類碳青霉烯酶為金屬β-內(nèi)酰胺酶(Metallo-beta-lactamase，MBL)，包括NDM-1、VIM2、IMP等。此類酶可水解頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素，但對單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素（氨曲南）和EDTA等螯合劑敏感，主要存在于銅綠假單胞菌、不動桿菌和腸桿菌科細菌。
　　產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶NDM-1的超級肺炎克雷伯桿菌于2009年首次在印度新德里被發(fā)現(xiàn)[4]，除了可以水解幾乎所有臨床常用藥，blaNDM-1常與其他

5、耐藥基因，比如ESBLs，共存共轉(zhuǎn)移擴大耐藥菌底物譜而引起廣泛關注。其中blaCTX-M-15在共轉(zhuǎn)移ESBLs耐藥基因中最為常見，同時blaCTX-M-15也是九十多種CTX-M亞型中世界范圍內(nèi)檢出率最高的一種。其次，blaTEM-1，blaOXA-1，blaOXA-10也常常被同時檢出[5]。CTX-M-15可高度水解頭孢噻肟，適度水解氨曲南，填補了NDM-1不能水解氨曲南的空白，兩者共存，擴大了攜帶NDM-1耐藥菌的耐藥范圍，增加

6、了感染NDM-1病人的用藥困難。
　　不僅如此，與NDM-1耐藥酶基因相關的可移動遺傳元件，如轉(zhuǎn)座子，整合子，毒力因子，可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒等，以及其他種類耐藥酶基因的存在，使得攜帶NDM-1的耐藥菌不僅對三代頭孢菌素類藥物耐藥，對其他大多數(shù)抗生素如喹諾酮類，氨基糖苷類藥物也耐藥，并且呈現(xiàn)傳播越來越廣泛的特點。目前已經(jīng)在肺炎克雷伯菌[6]，大腸埃希菌[7]以及枸櫞酸桿菌[8]中發(fā)現(xiàn)同時攜帶blaNDM-1和blaCTX-M-15的可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒

7、。最近幾年，在國內(nèi)也有關于NDM-1在不動桿菌屬[9-11]，屎腸球菌[12]，肺炎克雷伯菌[13]以及大腸埃希菌[14]中被發(fā)現(xiàn)的報道。由此可見，攜帶NDM-1以及同時攜帶NDM-1和CTX-M-15的革蘭氏陰性耐藥菌所造成的感染將成為革蘭氏陰性菌感染中最棘手的問題之一，并且大有傳播日益廣泛的威脅。
　　抗生素的濫用和不合理使用問題可依靠制定抗生素使用規(guī)范，加強抗菌藥物使用管理予以控制，而細菌耐藥性問題則需從多方面入手解決，一方

8、面加強對細菌的耐藥性監(jiān)測，指導臨床合理用藥（對指導臨床合理選藥，提高療效，控制多藥耐藥菌的流行有重要意義）;一方面，從基因水平對耐藥菌傳播機制進行研究，研發(fā)細菌耐藥抑制劑（如水解酶抑制劑、外排泵抑制劑等）;另一方面尋求新型抗菌藥物，如非抗生素的天然抗菌肽、人工合成雜合抗菌肽及抗菌抗體等。
　　基于以上背景，以及本實驗室保存有大量ATCC標準菌株和本地區(qū)醫(yī)院分離革蘭氏陰性菌等優(yōu)勢，本課題從三部分展開研究:
　　第一部分，對北京

9、地區(qū)2002-2004年及2010-2014年收集的625株臨床腸桿菌科細菌進行CRE耐藥率測定，結果顯示2002-2004年CRE耐藥率為0.8％，2010-2014年耐藥率增長至4.9％。同時對實驗室保存的7株同時攜帶blaNDM-1和blaCTX-M-15的特征腸桿菌科菌株進行整合子、不相容質(zhì)粒群、流行性質(zhì)粒及菌株分型、脈沖場凝膠電泳、耐藥機制分析等分子特征研究，為耐藥菌流行趨勢作出前瞻性研究，也為更進一步揭示革蘭氏陰性耐藥菌耐藥

10、機制提供了理論基礎。
　　第二部分，原核細胞重組表達標準菌株及臨床菌株中的碳青霉烯酶，建立重組碳青霉烯酶庫，用于篩選新型酶穩(wěn)定化合物或酶抑制劑，以及建立碳青霉烯酶質(zhì)譜庫，用于CRE菌株感染的早期診斷。表達的碳青霉烯酶分別為實驗室保存標準菌株 K.pneumoniae ATCC(R)BAA2146， K.pneumoniae ATCC(R)700603， K.pneumoniaeATCC(R)BAA1898和 K.pneumonia

11、e ATCC(R)BAA1905中的碳青霉烯酶CTX-M-15，SHV-18，KPC1/2，KPC3以及臨床菌株P.aeruginosa08-14和A.baumannii09-1中的碳青霉烯酶VIM2和OXA23。其中對CTX-M-15和VIM2進行了重組酶水解活性測定和酶抑制劑水解保護特性研究，以及酶促動力學參數(shù)測定。
　　第三部分，重組表達天然殺菌素ColicinⅠa，人工合成殺菌通透性增加蛋白(Batericidal per