1、目的：本實(shí)驗(yàn)通過體外原代培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察該細(xì)胞形態(tài)及生長方式，檢測中藥骨碎補(bǔ)對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞的增殖活性及細(xì)胞總蛋白合成的影響，為今后中藥骨碎補(bǔ)用于臨床治療牙齦及牙周疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：采用組織塊法培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡及光鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)。制備中藥骨碎補(bǔ)煎液，用MTT法和考馬斯亮藍(lán)染色法分別測定藥物作用下細(xì)胞的生長曲線及總蛋白合成等基本生物學(xué)特性，檢測中藥骨碎補(bǔ)對(duì)體外培養(yǎng)的人牙齦成

2、纖維細(xì)胞的增殖活性及細(xì)胞總蛋白合成的影響。 1牙齦成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及生物學(xué)特性觀察：河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔科拔除的阻生健康牙齒上，切取少量牙齦組織，將所取的牙齦組織立即放置于含有青霉素100u/ml、100μg/ml鏈霉素的預(yù)冷Hank's液中。采用組織塊法培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞。取第4代細(xì)胞胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板。每24h取3孔，吸棄培養(yǎng)液，胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，

3、取均值。連續(xù)觀察7d，繪制牙齦成纖維細(xì)胞的生長曲線。 2骨碎補(bǔ)煎液的制備：自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院中藥房購買中藥骨碎補(bǔ)，將骨碎補(bǔ)加入水中煎煮，過濾，用含2％FBS的培養(yǎng)液稀釋到10，50，100，500，1000μg/ml的終濃度，調(diào)pH至7.0～7.1，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?3細(xì)胞增殖效應(yīng)和細(xì)胞總蛋白含量的測定：取第4代細(xì)胞胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，孵育2

4、4h后吸棄培養(yǎng)液。分別將濃度不同的中藥骨碎補(bǔ)煎液加入到培養(yǎng)2，5，8d的牙齦成纖維細(xì)胞液中，MTT法及考馬斯亮藍(lán)染色法測定骨碎補(bǔ)作用后的人牙齦成纖維細(xì)胞的增殖效應(yīng)和細(xì)胞總蛋白含量。 結(jié)果： 1牙齦成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：牙齦成纖維細(xì)胞體外原代培養(yǎng)成功率為100％，倒置顯微鏡下牙齦成纖維細(xì)胞呈長梭形或紡錘形，為單核細(xì)胞，有長短不一的細(xì)胞突起，細(xì)胞核為圓形或卵圓形，大多位于胞漿中央，細(xì)胞排列呈束狀或漩渦狀。HE染色光鏡下觀察胞

5、質(zhì)豐滿，嗜伊紅，胞核嗜堿性。 2人牙齦成纖維細(xì)胞的生長曲線：生長曲線略呈“S”形，接種后第1d細(xì)胞數(shù)略有下降，第2d開始有所回升，但長勢(shì)緩慢。第3d開始曲線急劇上升，提示細(xì)胞生長速度加快，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，這一狀態(tài)持續(xù)至第5d。第6d開始進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞生長速度減緩。 3骨碎補(bǔ)對(duì)細(xì)胞的增殖效應(yīng)：10、50、100、500、1000μg/ml范圍內(nèi)各濃度中藥骨碎補(bǔ)組的牙齦成纖維細(xì)胞生長速度均高于對(duì)照組，骨碎補(bǔ)煎液在濃度為10

6、0μg/ml時(shí)對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞增殖效果最為顯著。隨著作用時(shí)間的延長，細(xì)胞的OD值逐漸增大，在第5天達(dá)到最大。不同作用時(shí)間組之間具有明顯的差異(P＜0.05)，在10、50、100、500、1000μg/ml范圍內(nèi)，骨碎補(bǔ)促增殖作用，顯示出一個(gè)明顯的濃度依賴效應(yīng)和時(shí)間依賴效應(yīng)。 4骨碎補(bǔ)對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞總蛋白合成的影響：10、50、100、500、1000μg/ml的骨碎補(bǔ)與對(duì)照組比較均明顯促進(jìn)人牙齦成纖維細(xì)胞總蛋白合成(P＜

7、0.05)，且骨碎補(bǔ)對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞總蛋白合成的促進(jìn)作用顯示出明顯的濃度依賴效應(yīng)。 結(jié)論： 1牙齦成纖維細(xì)胞體外原代培養(yǎng)成功率較高，可為牙齦及牙周病的研究提供大量的種子細(xì)胞。 2骨碎補(bǔ)提取液在10、50、100、500、1000μg/ml濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞接種2～,8天內(nèi)有促進(jìn)人牙齦成纖維細(xì)胞增殖的作用，其中細(xì)胞接種第5天，100μg/ml濃度的骨碎補(bǔ)對(duì)人牙齦細(xì)胞增殖效果最為顯著。 310、50、100、