1、研究背景和目的: 中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病（certral nervous system leukernia，CNSL）的診斷由于大多數(shù)化療藥物難以通過(guò)血腦屏障，使隱藏在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的白血病細(xì)胞不能被有效清除，成為白血病復(fù)發(fā)的主要原因之一。CNSL可在疾病的各個(gè)時(shí)期出現(xiàn)，但常發(fā)生在治療后緩解期，急性白血病在起病時(shí)較少合并CNSL，但如果沒(méi)有采用有效的預(yù)防措施，不但CNSL發(fā)生率高，而且預(yù)后差。陳懿建等[13]報(bào)道CNSL的發(fā)病率約為1

2、0～20%，其中急性淋巴細(xì)胞白血病并CNSL發(fā)生率為26～30%，急性非淋巴細(xì)胞白血病并CNSL發(fā)生率為5～18%。由于預(yù)防CNSL措施的采用，急性髓系白血病的CNS復(fù)發(fā)率已經(jīng)下降至5～10%，急性淋巴細(xì)胞白血病的CNS復(fù)發(fā)率降至2～10%[14]。故及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療CNSL可以提高患者的生存率和治愈率。目前中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[15]如下：1.有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征（尤其是顱內(nèi)壓增高的癥狀和體征）。2.有腦脊液的改變：（1）壓

3、力增高（>0.02kPa或200mmH2O）。（2）白細(xì)胞數(shù)>0.01×109/L。（3）涂片見(jiàn)到白血病細(xì)胞。（4）蛋白>450mg/L，或潘氏試驗(yàn)陽(yáng)性。3.排除其他原因造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)或腦脊液的相似改變。符合條件3加2中的（3）或其他任兩項(xiàng)者可診斷CNSL。無(wú)癥狀但有腦脊液改變者可診斷為CNSL。若只有腦脊液壓力持續(xù)升高，但經(jīng)抗CNSL治療后腦脊液壓力下降、恢復(fù)正常者可診斷CNSL。有癥狀無(wú)腦脊液改變者，如有腦神經(jīng)、脊髓或神經(jīng)根受累

4、的癥狀和體征。可排除其他原因所致，且經(jīng)抗CNSL治療后癥狀有明顯改善者可診斷為CNSL。CNSL起病具有隱匿性，早期的臨床表現(xiàn)多不典型，甚至無(wú)陽(yáng)性癥狀和體征。CNSL臨床表現(xiàn)主要有下列類(lèi)型：①顱內(nèi)壓增高；②顱神經(jīng)損害：③脊髓損害；④腦實(shí)質(zhì)浸潤(rùn)；⑤神經(jīng)根及周?chē)窠?jīng)損害。據(jù)研究，在光學(xué)顯微鏡下每微升腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中能看到1個(gè)白血病細(xì)胞時(shí)，CSF中就存在105個(gè)白血病細(xì)胞[16]。此時(shí)，CNSL已發(fā)展

5、到較嚴(yán)重程度，失去早期治療的機(jī)會(huì)。故早期診斷和預(yù)防CNSL很重要。目前早期診斷CNSL的指標(biāo)和方法很多，但臨床上尚無(wú)特異性和敏感性兼顧的方法。腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)CNSL早期診斷有重要價(jià)值，但CSF細(xì)胞學(xué)檢查只有在白血病細(xì)胞浸潤(rùn)腦膜時(shí)呈陽(yáng)性，而早期浸潤(rùn)腦實(shí)質(zhì)和周?chē)窠?jīng)的CSF的改變不明顯，甚至陰性，單純依靠CSF細(xì)胞學(xué)早期診斷CNSL較困難。因此尋找CNSL新的早期診斷指標(biāo)對(duì)預(yù)防和治療CNSL，提高患者的生存率和治愈率具有重要的臨床意義。

6、目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究表明腦腫瘤患者血清中SOD活性增高[32]，是否可通過(guò)檢測(cè)腦脊液中的SOD活性輔助診斷CNSL有待研究。 CNSL的治療現(xiàn)狀：目前對(duì)CNSL的治療主要是顱內(nèi)放療、鞘內(nèi)注射化療藥物和全身化療，這些治療方法雖然可使患者生存期延長(zhǎng)，但由于放療、化療副作用大，且多數(shù)藥物難以通過(guò)血腦屏障，而多次腰椎穿刺會(huì)增加患者痛苦，患者生活質(zhì)量下降，同時(shí)多次腰椎穿刺也會(huì)使穿刺失敗率增加。這給我們提出了尋找能通過(guò)血腦屏障治療CNSL的

7、新藥的課題。 青蒿琥酯研究現(xiàn)狀：青蒿琥酯為蒿素素的衍生物，青蒿素作為中藥青蒿中的抗瘧疾成分，是從菊科植物青蒿中提取的一種含有過(guò)氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯化合物，是我國(guó)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)被國(guó)際公認(rèn)的天然藥物，其高效、低毒、脂溶性好、抗瘧活性高的藥理特性[17-19]使之成為世界范圍的抗瘧疾首選藥。在青蒿素抗瘧作用原理的啟發(fā)下，國(guó)內(nèi)外不少實(shí)驗(yàn)室研究青蒿素用于抗腫瘤的可能性，結(jié)果證實(shí)了青蒿素及其衍生物有確切的抗腫瘤作用，且青蒿素類(lèi)藥物抗腫瘤具有選擇

8、性，能選擇性地抑制腫瘤細(xì)胞的體外生長(zhǎng)，誘導(dǎo)凋亡，抑制增殖，如白血病細(xì)胞、纖維肉瘤細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞。其結(jié)構(gòu)新穎、抗腫瘤機(jī)制與傳統(tǒng)藥物不同，與傳統(tǒng)藥物不存在交叉耐藥，這些特性使其具有抗多種腫瘤細(xì)胞、毒性低、可能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥[20]等優(yōu)勢(shì)，本課題根據(jù)青蒿素及其衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用和能透過(guò)血腦屏障而進(jìn)入腦組織的藥代動(dòng)力學(xué)特性[21]，推測(cè)青蒿琥酯有可能可以用于治療CNSL，成為CNSL治療的新藥。本研究組

9、在前期的實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了青蒿琥酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡與鐵代謝有關(guān)，機(jī)制考慮可能為青蒿琥酯與鐵反應(yīng)生成自由基而殺死癌細(xì)胞。而青蒿素類(lèi)藥物能夠透過(guò)血腦屏障，且口服青蒿素類(lèi)藥物比起化療藥物以及放療毒副作用小、方便、經(jīng)濟(jì)，如能證實(shí) CNSL患者的發(fā)病以及青蒿素類(lèi)藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與自由基的變化有關(guān)，那么，對(duì)應(yīng)用青蒿素類(lèi)藥物治療CNSL有重要的臨床意義。 基于以上情況，本研究旨在通過(guò)檢測(cè)抗氧化物之一 SOD活性在CNSL患者腦脊液中的變化，

10、以及SOD活性等抗氧化標(biāo)志物在青蒿琥酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡過(guò)程中的變化，探討SOD檢測(cè)在CNSL診斷中的意義及青蒿琥酯干擾作用機(jī)制。研究方法 （一）實(shí)驗(yàn)材料： 1.收集2008年1月到2009年1月南方醫(yī)院血液科30例中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患者腦脊液標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，25例無(wú)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的急性白血病患者腦脊液標(biāo)本作為對(duì)照組。 2.人慢粒急變K562細(xì)胞株在含10%小牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%

11、CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，每24～36h傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)本研究組前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇青蒿琥酯作用濃度為4×10-5mol/L、2×10-4mol/L、1×10-3mol/L三個(gè)濃度組，未加青蒿琥酯組為對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 （二）實(shí)驗(yàn)方法 1.腦脊液常規(guī)、生化及細(xì)胞涂片分析。 2.黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)腦脊液SOD活性。 3.AnnexinⅤ-PI雙染和Hochest33258檢

12、測(cè)不同濃度處理組青蒿琥酯誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡情況。 4.黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)不同濃度處理組青蒿琥酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡時(shí)SOD活性。 5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MnSOD、SeGPx mRNA的表達(dá)。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（Independent-Samples T Test）、單項(xiàng)方差分析（One-Way ANOVA）多重比較（LSD）及雙變量相關(guān)分析，P<0.05為有顯著

13、性差異的標(biāo)準(zhǔn)。 初步結(jié)論： 1.CNSL組患者腦脊液中白細(xì)胞數(shù)量、蛋白含量明顯比對(duì)照組高；提示了腦脊液中白細(xì)胞數(shù)量和蛋白含量的改變對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的診斷有意義；兩組腦脊液壓力、葡萄糖和氯結(jié)果比較無(wú)差異。說(shuō)明了腦脊液壓力、葡萄糖和氯對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的診斷可能非特異。 2.CNSL組患者腦脊液的SOD活性明顯高于對(duì)照組患者，且CNSL組患者腦脊液中白細(xì)胞數(shù)量和蛋白含量分別與SOD活性呈正相關(guān)關(guān)系，提示了氧化

14、損傷機(jī)制參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病發(fā)病過(guò)程，SOD活性的測(cè)定能否用于檢測(cè)疾病的進(jìn)展，觀察療效，判斷預(yù)后還有待進(jìn)一步研究。 3.不同年齡組中以45-59歲年齡組腦脊液SOD活性最高，<45歲年齡組SOD活力最低，<45歲年齡組與另兩個(gè)高年齡組腦脊液SOD活性比較有顯著性差異，45-59歲年齡組與>60歲組腦脊液SOD活性比較無(wú)差異，提示了腦脊液SOD活性的變化可能與年齡有關(guān)。 4.不同濃度（4×10-5 mol/L、2×10

15、-4mol/L、1×10-3 mol/L）的青蒿琥酯處理K562細(xì)胞48小時(shí)，細(xì)胞總凋亡率呈濃度依賴(lài)性，青蒿琥酯作用濃度越高，K562細(xì)胞凋亡率越高。隨著凋亡率的增加，K562細(xì)胞SOD活性以及MnSOD、SeGPx mRNA表達(dá)也隨著變化。各濃度組中以4×10-5mol/L組K562細(xì)胞SOD活性以及MnSOD、SeGPx mRNA表達(dá)最高。隨著青蒿琥酯作用濃度的繼續(xù)增加，凋亡率隨之升高，但K562細(xì)胞SOD活性以及MnSOD、SeG