1、本研究共分為三個部分： 1．通過改良抗原基因序列、與細胞因子基因或其他胰島自身抗原基因共表達的方法，構建和鑒定8種新的GAD65片段DNA疫苗，并在檢測其表達。 2．將構建好的8種GAD65片段DNA疫苗對NOD鼠進行預防實驗，觀察不同GAD65片段DNA疫苗對NOD鼠糖尿病發(fā)病和胰島炎的作用。 3．檢測幾種有效的GAD65片段DNA疫苗免疫對NOD鼠胰島β細胞凋亡、免疫耐受、Th1/Th1 免疫平衡、以及CD4

2、<'+>CD25<'+>調(diào)節(jié)性T細胞的作用，探討不同GAD65片段DNA疫苗預防NOD鼠糖尿病可能的作用機制。 第一部分 GAD65片段DNA疫苗的構建、鑒定與優(yōu)化。 目的:構建、鑒定和優(yōu)化以預防1型糖尿病為目的的編碼不同谷氨酸脫羧酶(GAD)65基因片段的DNA疫苗。 方法:從GAD65質(zhì)粒中擴增出GAD<,190-315>(GAD1)片段和GAD<,490-570>(GAD2)片段的cDNA，以overlap

3、 PCR法將之分別與IL-2信號肽cDNA拼接，得到帶信號肽的SGAD1、SGAD2融合基因。并分別以IL-4、IL-10及胰島原質(zhì)粒為模板，用PCR方法擴增出IL-4、IL-10和胰島素B鏈(InsB)基因。SGAD1、SGAD2、IL-4、IL-10和InsB基因先克隆入pGEM-T載體后，先將SGAD1、SGAD2融合基因分別克隆入雙啟動子真核表達載體pBudCE4.1中，構建出2種單基因重組真核表達載體pBud-SGAD1和pB

4、ud-SGAD2，再分別將IL-4、IL-10、InsB基因克隆入真核表達載體pBud-SGAD1和pBud-SGAD2中，構建出pBud-SGAD1/IL-4、pBud-SGAD1/IL-10、pBud-SGAD1/InsB、pBud-SGAD2/IL-4、pBud-SGAD2/IL-10、pBud-SGAD2/InsB 6種雙基因重組真核表達載體。重組真核表達載體經(jīng)測序鑒定正確后，用脂質(zhì)體介導的方法體外轉染COS-7細胞，轉染后以蛋

5、白質(zhì)印跡法檢測SGAD1、SGAD2及InsB的表達，ELISA方法檢測細胞因子IL-4和IL-10的表達。 結果: (1)核酸序列測定表明克隆的SGAD1、SGAD2融合基因、IL-4、IL-10和InsB基因序列與報告序列一致，開放讀碼框正確。 (2)蛋白質(zhì)印跡法檢測到SGAD1、SGAD2和InsB在COS-7細胞中的表達，其中融合蛋白SGAD1和SGAD2可以分泌表達。 (3)ELISA方法檢測到

6、細胞因子IL-4和IL-10在COS-7細胞中的表達。 結論:首次成功構建了pBud-SGAD1、pBud-SGAD2、pBud-SGAD1/IL-4、pBud-SGAD1/IL-10、pBud-SGAD1/InsB、pBud-SGAD2/IL-4、pBud-SGAD2/IL-10、pBud-SGAD2/InsB 8種新的GAD65片段DNA疫苗，為1型糖尿病的DNA疫苗預防研究提供了實驗基礎。 第二部分 GAD65片段

7、DNA疫苗對NOD鼠糖尿病和胰島炎的作用。 目的:探討優(yōu)化后的GAD65片段DNA疫苗對NOD鼠糖尿病發(fā)病和胰島炎的作用。 方法: 3-4 周齡NOD雌鼠隨機分為PBS組(n=20)、pBudCE組(n=18)、GAD65組(n=18)、SGAD1組(n=17)、SGAD2組(n=18)、SGAD1/IL-4 組(n=19)、SGAD1/IL-10 組(n=17)、SGAD1/InsB 組(n=20)、SGAD2/IL-

8、4 組(n=18)、SGAD2/IL-10 組(n=17)和SGAD2/InsB 組(n=19)11 個組，分別肌肉注射PBS、pBudCE空質(zhì)粒、pcDNA3.1(+)/GAD65 DNA疫苗和經(jīng)過優(yōu)化后的pBud-SGAD1、pBud-SGAD1/IL-4、pBud-SGAD1/IL-10、pBud-SGAD1/InsB、pBud-SGAD1 、pBud-SGAD2/IL-4、pBud-SGAD2/IL-10、pBud-SGAD2/

9、InsB DNA 疫苗，注射量為75 μg，一周后重復一次，兩次共150 μg。自10周齡開始，每周測尿糖一次，尿糖陽性后監(jiān)測血糖，連續(xù)兩次血糖≥16.7mmol/L即診斷為糖尿病，所有動物觀察至發(fā)生糖尿病或者至30周齡。各組再取6-8只12周齡未發(fā)病小鼠胰腺HE染色觀察胰島炎情況。 結果: (1)與PBS組相比， SGAD1、SGAD1/IL-4 和 SGAD1/IL-10 組NOD鼠糖尿病的發(fā)病明顯降低(P<0.05

10、或P<0.01)。 (2)無論與GAD65組相比，還是與SGAD1組相比，SGAD1/IL-4和SGAD1/IL-10組NOD鼠糖尿病的發(fā)病明顯降低(P<0.05或P<0.01)。 (3)與PBS組相比，pBudCE、SGAD1/InsB、SGAD2、SGAD2/IL-4、SGAD21IL-10和SGAD2/InsB組NOD鼠糖尿病的發(fā)病差異無顯著性。 (4)12周齡時，無論與PBS組或與GAD65組相比，pBu

11、d-SGAD1、pBud-SGAD1/IL-4、pBud-SGAD1/IL-10 DNA疫苗能夠降低NOD鼠胰島炎的嚴重程度(P<0.05或P<0.01)。 結論: pBud-SGAD1、pBud-SGAD1/IL-4、pBud-SGAD1/IL-10DNA 疫苗減輕胰島炎和預防NOD鼠糖尿病的療效優(yōu)于pcDNA3.1(+)/GAD65 DNA疫苗，其中 pBud-SGAD1/IL-4 和pBud-SGAD1/IL-10 DNA

12、 疫苗的療效更好。 第三部分 GAD65片段DNA疫苗預防NOD鼠糖尿病的機制探討。 目的:探討優(yōu)選的GAD65片段DNA疫苗預防NOD鼠胰島炎和糖尿病的機制。 方法: PBS組、pBudCE組、GAD65組、SGAD1組、SGAD1/IL-4組、SGAD1/IL-10組各取6-8只12周齡未發(fā)病NOD雌鼠并處死，TUNEL加SP免疫組織化學方法檢測胰島β細胞的凋亡情況；制備脾細胞懸液后，[<'3>H]摻入法檢測

13、脾細胞對特異性抗原GAD65的刺激增殖反應；流式細胞儀檢測脾細胞中CD4<'+>CD25<'+>調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量；ELISA 方法測定抗原刺激后脾細胞培養(yǎng)上清中Th1細胞因子IFN-γ，Th2 細胞因子IL-4、IL-10水平；RT-PCR方法檢測脾臟內(nèi)細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10和轉錄因子foxp3 mRNA的表達。 結果: (1)SGAD1、SGAD1/IL-4和SGAD1/IL-10組NOD鼠胰島β細

14、胞凋亡率均低于PBS組(均P<0.05)。 (2)GAD1、SGAD1/IL-4 和SGAD1/IL-10組NOD鼠脾細胞特異性抗原刺激增殖反應低于PBS組(均P<0.01)。 (3)SGAD1、SGAD1/IL-4 和SGAD1/IL-10組脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平均低于PBS組(均P<0.01)和GAD65組(均P<0.01)；SGAD1、SGAD1/IL-4 和 SGAD1/IL-10 組脾臟中IFN-γmR

15、NA表達水平也均低于PBS組(均P<0.01)和GAD65組(均P<0.01)。 (4)SGAD1、SGAD1/IL-4 和 SGAD1/IL-10組脾細胞培養(yǎng)上清中IL-4 水平均高于PBS組(P<0.05或P<0.01)，SGAD1/IL-4組的IL4水平高于GAD65組(P<0.05)；GAD1、SGAD1/IL-4和SGAD1/IL-10組脾臟中IL-4 mRNA表達水平高于PBS組(P<0.05或P<0.01)和GAD

16、65組(P<0.05或P<0.01)。 (5)SGAD1/IL-10 組脾細胞培養(yǎng)上清中IL-10水平高于PBS組(P<0.05)和GAD65組(P<0.05)；SGAD1/IL-4和SGAD1/IL-10組脾臟中IL-10 mRNA表達水平高于PBS組(P<0.05或P<0.01)和GAD65組(P<0.05)。 (6)各組間NOD鼠脾細胞中CD4m<'+>CD25<'+>調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量，以及脾臟中Foxp3 mR