1、目的：觀察VEGF-C基因下調(diào)后膀胱癌細(xì)胞株增殖和侵襲能力的改變，體外驗證VEGF-C基因做為治療靶點的可行性；應(yīng)用膀胱癌細(xì)胞系T24細(xì)胞建立膀胱癌的裸鼠移植瘤模型，并觀察重組質(zhì)粒CRM-30-shVEGF-C對裸鼠移植瘤組織內(nèi)VEGF-C表達(dá)的影響及對腫瘤的生長抑制作用，為其臨床開發(fā)應(yīng)用和探索腫瘤治療的新途徑提供實驗和理論基礎(chǔ)；篩選與VEGF-C相互作用的基因及可能的信號通路，探討VEGF-C基因在膀胱癌中的作用機制。 方法：

2、1、構(gòu)建II型啟動子啟動的新型microshRNA結(jié)構(gòu)的干擾質(zhì)粒CRM-30-shVEGF-C，對膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株T24和膀胱鱗癌細(xì)胞株ScaBER進(jìn)行轉(zhuǎn)染并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，應(yīng)用RT-PCR、Western-blot、ELISA、細(xì)胞免疫組化等方法研究干擾后細(xì)胞株VEGF-C表達(dá)水平的變化，應(yīng)用MTT及細(xì)胞克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖情況，用流式細(xì)胞技術(shù)研究其對細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響，應(yīng)用Transwell實驗和黏附實驗

3、驗證其轉(zhuǎn)移侵襲能力的改變。 2、①以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞株與T24細(xì)胞株進(jìn)行裸鼠皮下接種，進(jìn)行成瘤實驗；②以瘤塊皮下接種法建立裸鼠皮下膀胱腫瘤模型，成瘤后，分為四組，瘤內(nèi)分次多點注射Lipofectmin2000介導(dǎo)的CRM-30-shVEGF-C質(zhì)粒、CRM-30-non、PCDNA3.1/VEGF-C質(zhì)粒和單純的DMEM，研究VEGF-C對膀胱腫瘤的作用。治療過程中測量腫瘤體積，計算腫瘤抑制率，并觀察各組治療后腫瘤生長情況，

4、并繪制腫瘤生長曲線；應(yīng)用RT-PCR及Westernblot、免疫組化方法觀察VEGF-C在mRNA及蛋白質(zhì)水平表達(dá)的情況。 3、利用表達(dá)譜基因芯片技術(shù)分析T24細(xì)胞VEGF-C基因下調(diào)后全基因組表達(dá)譜的變化，篩選與VEGF-C相互作用的差異基因及信號通路。 結(jié)果：1、干擾質(zhì)粒對T24、ScaBER細(xì)胞均有較高的轉(zhuǎn)染效率，在mRNA及蛋白水平均能顯著降低VEGF-C的表達(dá)；干擾后，S期細(xì)胞的百分率降低，G1期的百分率升高

5、，凋亡細(xì)胞比例明顯增加；干擾質(zhì)粒能顯著抑制細(xì)胞增殖；干擾后，細(xì)胞的透膜率和黏附率明顯降低。 2、①CRM-30-shVEGF-C質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞成瘤能力下降了60％②成功用細(xì)胞接種法和瘤塊接種法構(gòu)建了裸鼠人膀胱癌T24細(xì)胞株的動物模型，T24細(xì)胞成瘤率為88％(22/24)。③VEGF-C表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3.1/VEGF-C能促進(jìn)腫瘤的生長；VEGF-C干擾質(zhì)粒CRM-30-shvEGF-C能抑制腫瘤的生長，并能延緩或

6、抑制腫瘤壞死出血的發(fā)生和荷瘤裸鼠惡液質(zhì)的出現(xiàn)。④RT-PCR和WesternBlot結(jié)果表明與DMEM對照組相比，PCDNA3.1/VEGF-C可顯著增高瘤體中VEGF-C在mRNA及蛋白水平的表達(dá)；CRM-30-shVEGF-C質(zhì)?？娠@著降低瘤體中VEGF-C在mRNA及蛋白水平的表達(dá)。 3、篩選出了1298個共同差異表達(dá)的基因，這些基因涉及到細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞分化等多個方面。VEGF-C基因下調(diào)后，

7、趨化因子家族基因CXCL3、IL8、CCL20、CXCL6、CXCL1、CXCL5、CXCL2下調(diào)，趨化因子受體CCR7上調(diào)，黏附因子家族中CD44、ITGB1、ITGA2下調(diào)，ITGA4、ITGB3、ITGB4、ICAM2上調(diào)。VEGF-C的下調(diào)也與Gadd45a的下調(diào)有關(guān)。 結(jié)論：1、在細(xì)胞水平上證實VEGF-C基因可以作為膀胱癌基因治療的有效靶點，為后續(xù)的以VEGF-C為靶點的膀胱癌基因治療體內(nèi)實驗奠定基礎(chǔ)。 2、

8、VEGF-C高表達(dá)能促進(jìn)腫瘤生長，使腫瘤出現(xiàn)壞死和出血，荷瘤裸鼠出現(xiàn)惡液質(zhì)；VEGF-C低表達(dá)則能抑制腫瘤細(xì)胞生長，延緩腫瘤出現(xiàn)壞死、出血以及惡液質(zhì)的出現(xiàn)。本研究從正反兩方面為以VEGF-C為靶點的腫瘤基因沉默療法提供了可靠的理論和實驗基礎(chǔ)。 3、在基因水平上證實了VEGF-C基因是影響細(xì)胞黏附和侵襲的重要因子，主要通過調(diào)控趨化因子家族基因和黏附因子家族基因而發(fā)揮作用，干擾VEGF-C后，膀胱癌通路中的許多基因均有明顯改變，進(jìn)一