1、Bcl-xl基因在膀胱癌中表達與RNA干擾的實驗研究膀胱腫瘤是泌尿外科最常見的惡性腫瘤，其臨床特點主要是高發(fā)病率、高復發(fā)率和低度惡性。目前認為膀胱腫瘤是一基因病，由多通路及多靶位調(diào)控，但其確切病因、發(fā)病機制及復發(fā)機制不清楚。近年來有關(guān)膀胱腫瘤發(fā)病的分子機制一直是研究的熱點，其中包括基因突變、原癌基因激活、抑癌基因失活及凋亡失衡等多種發(fā)病機制。 凋亡即細胞的程序性死亡，其調(diào)節(jié)機制的紊亂將導致腫瘤的發(fā)生。研究表明，腫瘤細胞凋亡的減少

2、與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的密切相關(guān)。并且使細胞耐受放療、化療的刺激。因而，誘導腫瘤細胞凋亡成為了一種新的殺傷腫瘤細胞的治療策略。 Bcl-xl作為一種抗凋亡蛋白基因，可保護細胞免于病毒、氧化劑等刺激誘導的細胞凋亡。Bcl-xl蛋白的高表達是腫瘤發(fā)生和產(chǎn)生耐藥性的重要原因之一。因此，利用RNA干擾技術(shù)，通過抑制Bcl-xl蛋白基因的表達，達到促進腫瘤細胞凋亡的目的，是目前正積極探索的一條新的腫瘤治療途徑。Bcl-xl屬Bcl-2抗凋亡家

3、族成員，其在多數(shù)惡性腫瘤組織中表達豐富，能抑制多種因素誘導的細胞凋亡。 RNA干擾(RNAi)是一種序列特異性、轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制，由雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)并導致與dsRNA序列同源的mRNA降解。向哺乳動物細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染雙鏈siRNA可導致快速的和有效的靶基因mRNA降解，并避免了由長的雙鏈RNA觸發(fā)的非特異效應。目前，RNAi己廣泛應用于基因組功能、抗病毒和抗腫瘤治療的研究。 本研究應用免疫組化方法測定Bcl-xl

4、及其相關(guān)基因Bak在膀胱癌組織中的蛋白表達，并利用體外轉(zhuǎn)錄合成的的小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)引發(fā)膀胱癌細胞株T24Bcl-xl基因沉默，借此研究對人膀胱癌細胞生物學行為的影響，為利用RNA干擾進行膀胱癌的治療提供理論基礎。 目的： 1.研究凋亡抑制基因Bcl-xl及其相關(guān)基因Bak在膀胱癌組織中的表達，并探討其與膀胱癌惡性生物學行為之間的關(guān)系。 2.建立體外siRNA的合成

5、制備方法，為RNA干擾的進一步研究提供技術(shù)平臺。 3.觀察膀胱癌細胞株T24中siRNA對Bcl-xl表達的抑制作用。 4.觀測siRNA體外抑制膀胱癌細胞Bcl-xl基因表達、誘導細胞凋亡效應及其對化療藥物順鉑(DDP)的增效作用。 方法： 1.對49例膀胱癌患者的臨床病理資料進行回顧性分析。應用Bcl-xl和Bak的抗體對上述患者的腫瘤組織切片進行免疫組織化學染色并進行統(tǒng)計學分析。 2.在ww

6、w.oligoengine.com上進行設計，得到三條siRNA序列。利用T7啟動子體外轉(zhuǎn)錄合成單鏈RNA，退火后得到dsRNA，對dsRNA進行消化并純化，獲得高純度的Bcl-xlsiRNA。 3.利用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)染至T24細胞中，半定量RT-PCR法篩選有效的靶序列，western-blot檢測siRNAs的抑制效應。 4.應用丫啶橙染色觀察轉(zhuǎn)染前后細胞形態(tài)變化，集落細胞形成試驗、MTT法檢測

7、siRNAs對細胞生長增殖抑制的效應；流式細胞術(shù)檢測siRNAs誘導細胞凋亡的效應。 5利用MTT檢測siRNA對化療藥物順鉑(DDP)的增效作用。 6.統(tǒng)計方法：應用SPSS11.0統(tǒng)計學軟件和方差分析來分析比較各組實驗數(shù)據(jù)。 結(jié)果： 1在TCCB中Bcl-xl、Bak有不同程度的陽性表達，二者差異均有顯著性，隨著TCCB臨床病理分期、分級的升高，Bcl-xl和Bak的蛋白表達呈現(xiàn)增高趨勢，有統(tǒng)計學意義

8、；Bcl-xl、Bak表達情況與腫瘤臨床病理分期、分級有相關(guān)性。 2成功體外合成3條siRNA，長度為21bp。 3與對照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA的T24細胞Bcl-xlmRNA表達水平明顯下降。 4western-blot表明T24細胞中轉(zhuǎn)染組Bcl-xl蛋白表達明顯低于未轉(zhuǎn)染組細胞，差異具有統(tǒng)計學意義。 5MTT結(jié)果：兩處理組細胞轉(zhuǎn)染后每天所測抑制率均顯著高于對照組(p＜0.01)表明細胞經(jīng)siRNA3

9、處理后生長受到明顯抑制：兩處理組細胞生長抑制率隨時間而增高，表明siRNA對癌細胞的抑制可維持一定時間。 6集落形成實驗結(jié)果：A、B、C三組細胞在第7天集落形成數(shù)分別為237±8、202±10、87±11，處理組明顯低于對照組；實驗結(jié)果表明處理組細胞在Bcl-xl受抑后，細胞生長增殖受到明顯抑制。 7.FCM檢測結(jié)果顯示，siRNA3組轉(zhuǎn)染24h后即可見凋亡峰(Ap峰)，并隨轉(zhuǎn)染時間延長漸趨明顯，24h后siRNA組細胞

10、凋亡指數(shù)(AI)已明顯高于對照組；AO熒光染色顯示細胞萎縮、染色質(zhì)濃縮、胞核致密濃染等典型凋亡改變。 結(jié)論： 1.膀胱癌組織中Bcl-xl、Bak表達明顯高于正常組織，且在膀胱細胞系T24中同樣檢測到了Bcl-xl的高表達。表明Bcl-xl與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可望成為膀胱癌的病情檢測及早期診斷的生物學標志。 2.體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNAs能特異有效的下調(diào)Bcl-xl基因的表達，不同序列特異性的siRNA