1、目的：構(gòu)建ATX基因短發(fā)夾狀RNA(shRNA)質(zhì)粒表達(dá)載體，研究其對(duì)人MHCC-97肝癌細(xì)胞ATx基因表達(dá)、增殖和運(yùn)動(dòng)能力的抑制作用，探索RNAi用于肝癌治療的新途徑。 方法： 1.設(shè)計(jì)合成含有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的ATX-shRNA對(duì)應(yīng)模板DNA序列兩對(duì)及隨機(jī)陰性對(duì)照，煺火處理后克隆至pSliencer 2.1-U6質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSlienc-er-ATX。 2.培養(yǎng)人肝癌MHCC-97細(xì)胞株，在陽(yáng)離子脂質(zhì)體的介

2、導(dǎo)下將pSliencer-ATX 轉(zhuǎn)染人肝癌MHCC-97細(xì)胞。 3.實(shí)驗(yàn)分空白組、脂質(zhì)體組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。 4.分別于轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、7天收集細(xì)胞。 5.RT-PCR檢測(cè) ATX mRNA的表達(dá)。 6.MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖。 8.腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的變化。 結(jié)果： 1.酶切及測(cè)序證實(shí)質(zhì)粒表達(dá)載體pSliencer-ATx構(gòu)建成功。

3、2.ATX-shRNA可顯著抑制人Ml-Ice-97肝癌細(xì)胞ATX mRNA的表達(dá)，半定量RT-PCR檢測(cè)顯示ATXmRNA的表達(dá)在轉(zhuǎn)染后第一天開(kāi)始降低，第四天抑制作用最明顯，第五天抑制作用減弱。檢測(cè)顯示shRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞第四天ATX mRNA的表達(dá)較空白組受到明顯抑制[73.7±4.5]％(P<0.01)。 3抑制細(xì)胞的增殖：與空白對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染ATX-shRNA后顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖[63.3±5.3]％(P<0.05

4、)。 4．細(xì)胞的侵襲力減弱：與空白對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染ATX-shRNA后肝癌細(xì)胞穿過(guò)人工基底膜的個(gè)數(shù)明顯減少[(98±10)vs(222±12)](P<0.01)，表明侵襲力明顯減弱。 5．細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力減弱：與空白對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染ATX-shRNA后肝癌細(xì)胞穿過(guò)Tran-swell小室濾膜的個(gè)數(shù)明顯減少[(18l±6)vs(379±7)](P<0.01)，表明運(yùn)動(dòng)能力明顯減弱。 6．ATx-shRNA轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)A