1、目的：自然殺傷(Natural killer，NK)細胞是機體主要的效應淋巴細胞，可清除體內(nèi)的腫瘤細胞并抵御病毒、細菌等的入侵，發(fā)揮天然免疫監(jiān)視功能。腫瘤患者體內(nèi)NK細胞數(shù)量及活性降低與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，是腫瘤免疫逃逸的關鍵因素。通過激活內(nèi)源性NK細胞或?qū)Ⅲw外活化的NK細胞進行過繼性轉(zhuǎn)移，有望增強癌癥患者機體免疫能力，對改善臨床預后和提高存活率具有重要意義。NK細胞活性受大量細胞因子的調(diào)節(jié)。白細胞介素-18(Interleukin

2、-18，IL-18)是一種多功能細胞因子，強烈誘導NK細胞分泌IFN-γ并促進NK細胞的活化，從而影響NK細胞的抗腫瘤效應。當IL-18聯(lián)合其他細胞因子如IL-12或IL-15體外刺激NK細胞時，對NK細胞的增殖、細胞毒性以及INF-γ分泌能力呈現(xiàn)更為顯著的增強效應。白細胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）曾被廣泛應用于惡性腫瘤免疫治療，然而大劑量IL-2使用所引起的嚴重并發(fā)癥極大地限制了其在腫瘤免疫治療中的應用價值。目前

3、，國際上研究熱點是將IL-2與其他細胞因子聯(lián)合應用，以降低IL-2的不良反應。臨床研究發(fā)現(xiàn)，將重組人IL-18應用于進展期癌癥患者時，與其他細胞因子相比，IL-18具有極少的毒副作用，且其發(fā)揮生物學活性的安全劑量范圍更廣。IL-18與IL-2聯(lián)合應用有望成為增強NK細胞抗腫瘤效應的有效策略，但目前IL-18聯(lián)合IL-2對NK細胞的具體調(diào)節(jié)作用及其機制尚不明確。
　　本實驗旨在觀察IL-18和IL-2聯(lián)合誘導的人外周血NK細胞對腫瘤

4、細胞的殺傷活性及其表面活化性受體NKG2D表達情況，探究IL-18和IL-2對NK細胞的協(xié)同誘導活化作用，并初步分析其調(diào)節(jié)機制，為腫瘤免疫治療提供新的思路和理論依據(jù)。
　　方法：Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從肝素抗凝的人外周靜脈全血中無菌分離出外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。不同濃度的重組人IL-18(0，100，200 ng/ml)和重組人IL-

5、2(0，100，200 U/ml)體外聯(lián)合誘導新鮮分離的人PBMCs48 h，實驗分為IL-18和IL-2聯(lián)合處理組、IL-18單獨處理組、IL-2單獨處理組以及對照組（未經(jīng)細胞因子處理）。三色熒光-流式細胞分析技術檢測CD107a陽性NK細胞比率以評估NK細胞對人白血病細胞K562和人結腸癌細胞HT29的殺傷活性。同樣方法檢測活化性受體NKG2D在NK細胞表面的表達水平變化。
　　結果：1.IL-18和IL-2聯(lián)合誘導新鮮分離的

6、人PBMCs48 h后，CD107a陽性NK細胞比率顯著升高，明顯高于IL-18或IL-2單獨處理組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，提示NK細胞對腫瘤細胞K562和HT29的殺傷活性顯著增強。
　　2.不同的細胞因子刺激后，各實驗組CD3-CD56+ NK細胞占淋巴細胞群的百分比無顯著性差異(P＞0.05)，提示IL-18與IL-2聯(lián)合應用對人NK細胞的增殖無明顯促進作用。
　　3.新鮮分離的人PBMCs經(jīng)IL-18（2

7、00 ng/ml）和IL-2(100 U/ml)刺激48 h后，流式細胞術分析結果顯示，與單一應用IL-18或IL-2相比，IL-18和IL-2聯(lián)合處理組NK細胞表面NKG2D受體表達水平明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.細胞因子刺激過的人PBMCs經(jīng)抗NKG2D中和抗體處理1h以阻斷NKG2D介導的信號轉(zhuǎn)導后，IL-18聯(lián)合IL-2對NK細胞殺傷活性的上調(diào)作用被大大削弱，提示IL-18和IL-2對NK細胞毒活