1、研究背景與目的：
　　 異基因造血干細(xì)胞移植是治療惡性血液病的有效手段，但是，對(duì)于高度危險(xiǎn)型白血病，Allo-HSCT后復(fù)發(fā)率仍然高達(dá)81％。如何提升GVL效應(yīng)，降低移植后復(fù)發(fā)率是提升高度危險(xiǎn)型白血病治療效果的關(guān)鍵所在。
　　 Allo-HSCT中，同種異體反應(yīng)性自然殺傷細(xì)胞因具有對(duì)惡性細(xì)胞殺傷的高效性和對(duì)受者正常細(xì)胞的低損傷性，是GVL效應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞。
　　 NK細(xì)胞的效應(yīng)發(fā)揮受HLA-KIR等抑制性信號(hào)和

2、NKG2DL-NKG2D等活化性信號(hào)共同調(diào)節(jié)，二者對(duì)沖后的優(yōu)勢(shì)信號(hào)決定NK細(xì)胞的功能狀態(tài)。單倍體相合移植中，HLA單倍體相合供者NK細(xì)胞表面的KIR和與受者靶細(xì)胞表面的HLA分子結(jié)合，可傳遞殺傷抑制信號(hào)，抑制了NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷。針對(duì)這一靶點(diǎn)，本研究采用封閉供者NK細(xì)胞抑制性KIR表達(dá)的方法，人工誘導(dǎo)KIR錯(cuò)配，減少對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的抑制，以其提升NK細(xì)胞抗白血病效應(yīng)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 第一部分Ly49-H

3、-2信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)的體外研究
　　 以Balb/C(H-2d)×C57BL/6(H-2b)雜交F1代(H-2d/b小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞作為NK細(xì)胞來(lái)源，MACS陽(yáng)選得DX5+NK細(xì)胞。流式細(xì)胞儀(Flow cytometry,FCM)檢測(cè)NK細(xì)胞純度和編輯前、后NK細(xì)胞表面Ly49表達(dá)。常規(guī)培養(yǎng)NK細(xì)胞敏感靶細(xì)胞YAC-1，LDH釋放法用于檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)其殺傷活性。以C57BL/6鼠源性紅白血病細(xì)胞株FBL-

4、3為靶，LDH釋放法檢測(cè)未處理NK細(xì)胞組(編輯前NK細(xì)胞組)、抗體阻斷NK細(xì)胞組(14B11單抗與NK細(xì)胞共孵育)、編輯后NK細(xì)胞組(效靶細(xì)胞10∶1共孵育24h)和抗體阻斷編輯后NK細(xì)胞組對(duì)其殺傷活性。
　　 第二部分 RNAi-Ly49對(duì)NK細(xì)胞體外殺傷腫瘤細(xì)胞效應(yīng)的影響
　　 F1代鼠NK細(xì)胞分離純化同第一章，編號(hào)為124，335，589，91的四條siRNAoligo轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測(cè)干擾后各組NK細(xì)胞Ly

5、49C表達(dá)以篩選有效siRNAoligo。選取最高抑制組NK細(xì)胞，LDH釋放法檢測(cè)其對(duì)YAC-1和FBL-3細(xì)胞殺傷活性。
　　 第三部分 RNAi-Ly49對(duì)單倍體相合移植模型中NK細(xì)胞GVL效應(yīng)的影響雌性荷白血病C57BL/6鼠為受者，雄性CB6F1小鼠為供者，進(jìn)行骨髓移植。受鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。移植組在9Gy照射后行F1到C57移植構(gòu)建單倍體相合小鼠移植模型，觀察GVL效應(yīng)。
　　 A組，未處理白血病組

6、r>　　 B組，單純照射組
　　 C組，照射后單純移植組，輸注骨髓細(xì)胞1×107/只
　　 D組，照射后移植骨髓細(xì)胞和未處理NK細(xì)胞，照射后1h輸注未處理F1代鼠NK2×106/只，4h后輸注F1代鼠骨髓細(xì)胞1×107/只
　　 E組，照射后移植骨髓細(xì)胞和RNAi-Ly49處理后NK細(xì)胞，照射后1h輸注siRNA轉(zhuǎn)染后F1代鼠NK2×106/只，4h后輸注F1代鼠骨髓細(xì)胞1×107/只。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)方

7、法
　　 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示，所用統(tǒng)計(jì)方法主要包括單向方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、生存曲線(xiàn)以Kaplan-Meier法制作，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分 Ly49-H-2信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)
　　 1，分選所得NK細(xì)胞殺傷活性測(cè)定
　　 以小鼠NK細(xì)胞的敏感細(xì)胞株YAC-1為靶細(xì)胞，分選

8、得F1代NK細(xì)胞的殺傷活性隨效靶比升高而增強(qiáng)，NK細(xì)胞的殺傷活性正常。5∶1時(shí)(24.80±0.85)％，10∶1時(shí)為(45.95±2.09)％，20∶1時(shí)為(60.71±1.04)％，40∶1時(shí)為(79.54±0.94)％。
　　 2，各組NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)檢測(cè)
　　 以C57BL/6鼠源性紅白血病細(xì)胞FBL-3為靶，各組NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性經(jīng)單向方差分析，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=228.390，

9、P=0.000)。以未處理NK細(xì)胞組殺傷效應(yīng)(20.57±1.22)％為基線(xiàn)數(shù)據(jù)，抗體阻斷NK細(xì)胞組殺傷效應(yīng)與之相比顯著增強(qiáng)(P=0.000)，編輯后NK細(xì)胞組殺傷效應(yīng)與之相比顯著減弱(P=0.000)。FCM測(cè)得編輯后NK細(xì)胞組Ly49C(C57BL/6鼠KIR)表達(dá)率為(84.98±1.25)％，與未處理組NK(52.27±2.57)％相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.927，P=0.000)?？贵w阻斷編輯后NK細(xì)胞組殺傷效應(yīng)與編輯

10、后NK細(xì)胞組相比，顯著增強(qiáng)(P=0.000)。
　　 結(jié)果顯示，Allo-NK細(xì)胞可以殺傷YAC-1和FBL-3細(xì)胞，二者對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的敏感程度不同。NK細(xì)胞的活化狀態(tài)由抑制性信號(hào)和活化性信號(hào)的強(qiáng)度共同決定。腫瘤細(xì)胞編輯誘導(dǎo)KIR(Ly49)表達(dá)上調(diào)可降低NK細(xì)胞殺傷活性，以單克隆抗體14B11阻斷Ly49抑制性信號(hào)通路，促進(jìn)了對(duì)沖信號(hào)向激活性信號(hào)的偏移，增強(qiáng)了NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。
　　 第二部分 RNAi-Ly

11、49影響NK細(xì)胞體外殺傷腫瘤細(xì)胞效應(yīng)
　　 1，轉(zhuǎn)染后各組NK細(xì)胞的Ly49C表達(dá)
　　 轉(zhuǎn)染編號(hào)為124、335、91、589的siRNA序列，轉(zhuǎn)染后48h FCM檢測(cè)NK細(xì)胞的Ly49C表達(dá)率，分別為(27.48±2.79)％，(52.73±2.14)％，(40.98±4.29)％，(33.26±2.77)％。
　　 2，siRNA干擾后NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)
　　 以編號(hào)為124的siRNA序

12、列的抑制率最高，達(dá)48％。干擾后NK細(xì)胞對(duì)YAC-1細(xì)胞殺傷活性為(58.77±1.60)％(E∶T=20∶1)，與未處理組(60.71±1.04)％相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(t=1.757，P=0.154)。干擾后NK細(xì)胞對(duì)FBL-3細(xì)胞的殺傷活性達(dá)(29.08±2.91)％，與未處理組(20.57±1.22)％相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.664，P=0.010)。
　　 結(jié)果顯示，體外實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染后NK細(xì)胞對(duì)YAC-1細(xì)胞殺

13、傷功能與未處理組NK細(xì)胞相比無(wú)顯著性差異，結(jié)果和YAC-1細(xì)胞來(lái)源品系A(chǔ)/Sn與CB6F1小鼠完全錯(cuò)配相吻合。單倍體相合的FBL-3細(xì)胞則顯示不同情況，轉(zhuǎn)染后NK細(xì)胞KIR表達(dá)下調(diào)，使NK細(xì)胞偏向活化的功能狀態(tài)，提高了其對(duì)FBL-3細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。
　　 第三部分 RNAi-Ly49影響單倍體相合移植模型中NK細(xì)胞GVL效應(yīng)實(shí)驗(yàn)各組小鼠存活狀態(tài)觀察
　　 A組未作處理，白血病進(jìn)展迅速，小鼠全部于8-11天死亡，生存時(shí)間(

14、9.43±1.06)d
　　 B組照射后未做移植，小鼠體重迅速下降，生存時(shí)間(9.23±0.40)d，均死于造血衰竭(WBC＜0.5×109/L)
　　 C組2只存活超過(guò)30天，生存時(shí)間(23.88±8.65)d。
　　 D組4只存活超過(guò)30天，生存時(shí)間(30.14±8.56)d，對(duì)照未處理組，抑制率=319.62％；對(duì)照單純移植組，抑制率=126.21％。
　　 E組5只存活超過(guò)30天，生存時(shí)間(33.

15、74±6.71)d，對(duì)照未處理組，抑制率=357.79％；對(duì)照單純移植組，抑制率=141.29％。
　　 結(jié)果顯示，在荷白血病小鼠模型觀察NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)，以生存期為觀察指標(biāo)推算抑制率，設(shè)未處理的A組為對(duì)照，E組抑制率為357.79％，高于D組38.17％；設(shè)未輸注NK細(xì)胞的C組為對(duì)照，D組抑制率為126.21％，E組抑制率高過(guò)D組15.08％，達(dá)141.29％。說(shuō)明通過(guò)人工誘導(dǎo)KIR錯(cuò)配的方法提高單倍體相合KIR的錯(cuò)配率，

16、進(jìn)一步提升了NK細(xì)胞的GVL效應(yīng)。
　　 結(jié)論：
　　 1.體外功能實(shí)驗(yàn)，效應(yīng)細(xì)胞NK的活化狀態(tài)由抑制性信號(hào)和活化性信號(hào)的強(qiáng)度共同決定。以單克隆抗體14B11阻斷Ly49表達(dá)和RNAi-Ly49干擾抑制性信號(hào)通路傳導(dǎo)，促進(jìn)了對(duì)沖信號(hào)向激活性信號(hào)的偏移，增強(qiáng)了NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。
　　 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，荷白血病小鼠模型觀察NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)，以生存期為觀察指標(biāo)推算抑制率：設(shè)未處理的A組為對(duì)照，E組抑制率為

17、357.79％，高于D組38.17％；設(shè)未輸注NK細(xì)胞的C組為對(duì)照，D組抑制率為126.21％，E組抑制率高過(guò)D組15.08％，達(dá)141.29％。說(shuō)明通過(guò)人工誘導(dǎo)KIR錯(cuò)配的方法提高單倍體相合KIR的錯(cuò)配率，提升了NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。
　　 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)：理論方面，提出通過(guò)阻斷供者NK細(xì)胞KIR(Ly49)的表達(dá)，模擬臨床的KIR錯(cuò)配，誘導(dǎo)供者NK細(xì)胞對(duì)受者的殺傷作用，以增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)，降低白血病移植后復(fù)發(fā)率。實(shí)驗(yàn)方

18、法方面，采用的移植模式為F1(C57B/6×BALB/c)(H-2b/d，Ly49A+Ly49C+)向C57BL/6小鼠(H-2b，Ly49C+)骨髓移植，其中Ly49A+Ly49C+的供者NK細(xì)胞，在阻斷Ly49C表達(dá)后，保留Ly49A的表達(dá)，可以識(shí)別自身的H-2d，從而在誘導(dǎo)供者NK細(xì)胞對(duì)受者白血病細(xì)胞和骨髓細(xì)胞殺傷的同時(shí)，保留對(duì)自身耐受，以保證供者細(xì)胞能順利植入、實(shí)現(xiàn)造血重建。
　　 研究?jī)r(jià)值：本研究為提升NK細(xì)胞的抗腫瘤