1、血吸蟲(chóng)病是由血吸蟲(chóng)感染引起的一種危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲(chóng)病。據(jù)WHO的最新報(bào)道，人體血吸蟲(chóng)病流行于亞州、非洲及拉丁美洲的74個(gè)國(guó)家和地區(qū)，估計(jì)有7億人口受到血吸蟲(chóng)病的威脅，約2.07億人口被感染，其中85％的感染者存在于亞洲，每年全球約有百萬(wàn)人死于此病。我國(guó)是日本血吸蟲(chóng)病流行區(qū)，尚有454個(gè)疫區(qū)縣(市、區(qū))，約6千萬(wàn)人受到血吸蟲(chóng)病威脅，感染人數(shù)近41萬(wàn)。經(jīng)過(guò)半個(gè)世紀(jì)的努力，至今仍未有一種安全有效的疫苗能成功應(yīng)用于血吸蟲(chóng)病的預(yù)防。目前治療

2、與控制血吸蟲(chóng)病主要依賴于化學(xué)藥物-吡喹酮，然而由于反復(fù)用藥引起耐藥性的機(jī)會(huì)將可能增加。因此，開(kāi)發(fā)新的防治策略對(duì)血吸蟲(chóng)病的長(zhǎng)期控制具有重要意義。血吸蟲(chóng)在其流行傳播過(guò)程中，需要經(jīng)歷復(fù)雜的生命周期。若以干擾血吸蟲(chóng)的生命周期為靶點(diǎn)，通過(guò)對(duì)調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵基因的尋找及其功能的研究可能達(dá)到阻斷血吸蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的目的，為血吸蟲(chóng)病的預(yù)防提供新思路。
　　 調(diào)節(jié)血吸蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制十分復(fù)雜，目前研究主要集中在TGF-β(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子beta)及

3、PTK(蛋白酪氨酸激酶)信號(hào)通路的研究。由于扁形蠕蟲(chóng)的穩(wěn)定細(xì)胞系至今尚未建立，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系常被用來(lái)評(píng)價(jià)一些血吸蟲(chóng)信號(hào)通路蛋白的功能。作為多梳蛋白家族(Polycomb group)成員之一，bmi1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site1，B細(xì)胞特異性小鼠白血病病毒整合位點(diǎn)1)基因已在模式生物及哺乳動(dòng)物中顯示具有調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖及維持干細(xì)胞自

4、我更新的重要功能，然而對(duì)于日本血吸蟲(chóng)bmi1基因的功能所知甚少。本研究以BMI1的環(huán)指保守功能域序列對(duì)日本血吸蟲(chóng)的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)搜索，最終找到日本血吸蟲(chóng)的bmi1基因序列，命名為Sjbmi1。通過(guò)分子克隆表達(dá)技術(shù)獲得純化的SjBMI1蛋白及抗血清，血清學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示重組SjBMI1(rSjBMI1)蛋白可以被日本血吸蟲(chóng)感染血清識(shí)別，而且Anti-rSjBMI1抗血清可以識(shí)別成蟲(chóng)及蟲(chóng)卵粗抗原中的對(duì)應(yīng)蛋白條帶；定量PCR(qPCR)及免

5、疫印跡(western blot,WB)實(shí)驗(yàn)證實(shí)Sjbmi1基因高表達(dá)于雙性感染的成蟲(chóng)及蟲(chóng)卵階段，免疫熒光(immunofluorescence，IF)實(shí)驗(yàn)顯示在雙性感染的雄性成蟲(chóng)的睪丸及雌性成蟲(chóng)的卵巢高表達(dá)SjBMI1，而單性感染的雄蟲(chóng)睪丸及雌蟲(chóng)卵巢未顯示SjBMI1的表達(dá)；Sjbmi1基因可以在人鼻咽癌細(xì)胞(CNE2)中進(jìn)行異源性表達(dá)，并且MTT、細(xì)胞周期檢測(cè)、損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞核Hoechst染色實(shí)驗(yàn)顯示Sj bmi1的表達(dá)會(huì)抑制

6、CNE2細(xì)胞增殖活性及遷移能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；WB及逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)顯示SjBMI1可抑制內(nèi)源性人BMI1(hBMI1)蛋白表達(dá)，但對(duì)hBMI1 mRNA的表達(dá)沒(méi)有影響，揭示其抑制作用主要在轉(zhuǎn)錄后的蛋白表達(dá)階段。
　　 本論文對(duì)SjBMI1基因的結(jié)構(gòu)特征、表達(dá)模式及功能研究進(jìn)行了較為系統(tǒng)的闡述，對(duì)深入理解日本血吸蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、生命周期轉(zhuǎn)換及生殖器官成熟機(jī)制具有重要意義，并從干預(yù)血吸蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育角度為血吸蟲(chóng)病的防治提供了重要線索

7、。
　　 1、研究目的：
　　 基于哺乳動(dòng)物及模式生物研究中bmi1基因在生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖及干細(xì)胞自我更新方面的重要功能，尋找與認(rèn)識(shí)日本血吸蟲(chóng)bmi1同源基因?qū)?duì)血吸蟲(chóng)防治工作及深入理解日本血吸蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制具有重要意義，本研究目的包括：
　　 (1)尋找識(shí)別、克隆表達(dá)及鑒定Sjbmi1基因；(2)研究SjBMI1在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式及其組織學(xué)定位，探討其在日本血吸蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育及生殖器官形成中的作用；(3)

8、異源性表達(dá)Sjbmi1基因，在細(xì)胞水平探討其調(diào)控細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。
　　 2、研究方法：
　　 2.1日本血吸蟲(chóng)bmi1(Sjbmi1)的基因識(shí)別及基因結(jié)構(gòu)
　　 從公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載人、大鼠、小鼠、果蠅的bmi1基因序列，進(jìn)行序列比對(duì)，找出環(huán)指保守功能域，以此序列在日本血吸蟲(chóng)核酸序列庫(kù)中進(jìn)行tblastn比對(duì)，找到一條與hBMI1相似度最高的EST序列(GenBank Accession NO.AY815872.

9、1)，進(jìn)一步分析其ORF序列，發(fā)現(xiàn)在第93位可能存在點(diǎn)缺失，最終通過(guò)測(cè)序證實(shí)在此位點(diǎn)缺失一個(gè)T堿基(完整序列：gb/Eu912526.1)。將Sjbmi1全長(zhǎng)序列與日本血吸蟲(chóng)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，找出包含此基因的contigs，從而分析Sjbmi1基因的外顯子與內(nèi)含子分布。
　　 2.2Sjbmi1的生物信息學(xué)分析
　　 利用ExPASY的生物信息學(xué)工具進(jìn)行SjBMI1理化特征的預(yù)測(cè)、結(jié)構(gòu)域的分析、三維空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)建及針

10、對(duì)關(guān)鍵功能域進(jìn)化樹(shù)的繪制。
　　 2.3Sjbmi1的基因擴(kuò)增、克隆和重組蛋白的表達(dá)純化
　　 2.3.1Sjbmi1的基因擴(kuò)增、克?。焊鶕?jù)目的基因的ORF和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA中擴(kuò)增出Sjbmi1的CDS。定向克隆該序列到質(zhì)粒pET-28a中，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。
　　 2.3.2 rSjBMI1蛋白的表達(dá)和純化：將

11、構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28a-SjBMI1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE)，誘導(dǎo)表達(dá)后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰電泳(SDS-PAGE)鑒定rSjBMI1蛋白的表達(dá)，親和層析獲得純化的rSjBMI1蛋白。
　　 2.4 rSjBMI1的免疫血清學(xué)鑒定
　　 rSjBMI1免疫大鼠后獲得抗血清。用WB法鑒定rSjBMI1，包括用rSjBMI1抗血清識(shí)別日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵與成蟲(chóng)的粗抗原、感染S.japonicum的兔血清識(shí)別rS

12、jBMI1蛋白及抗HIS-tag單克隆抗體識(shí)別rSjBMI1蛋白。
　　 2.5Sjbmi1在日本血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段的表達(dá)
　　 TRIzol法分別提取日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵、尾蚴、雙性感染的雄性成蟲(chóng)及雌性成蟲(chóng)的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，采用設(shè)計(jì)的特異性引物，利用定量PCR(qPCR)對(duì)cDNA中的Sjbmi1基因進(jìn)行擴(kuò)增，了解不同階段其mRNA表達(dá)水平。各取20μg不同階段蟲(chóng)體粗抗原用于WB分析，了解不同階段SjBMI1

13、蛋白表達(dá)水平。
　　 2.6 SjBMI1在日本血吸蟲(chóng)的組織定位
　　 制備蟲(chóng)卵及成蟲(chóng)的組織切片，采用免疫熒光法，用抗rSjBMI1大鼠血清對(duì)蟲(chóng)卵、雙性感染的雄性成蟲(chóng)、雌性成蟲(chóng)及單性感染的雄性成蟲(chóng)、雌性成蟲(chóng)中的SjBMI1進(jìn)行免疫定位。
　　 2.7Sjbmi1基因的表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的影響
　　 構(gòu)建pIRES2-EGFP-SjBMI1重組質(zhì)粒，質(zhì)脂體轉(zhuǎn)染后在人鼻咽癌細(xì)胞(CNE2)中進(jìn)行異源性表

14、達(dá)。采用MTT及細(xì)胞周期法評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖活性，細(xì)胞核染色法評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡水平，損傷修復(fù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞的遷移與增殖能力。
　　 2.8Sjbmil基因?qū)?nèi)源性hbmi1基因表達(dá)的影響
　　 在人鼻咽癌細(xì)胞中進(jìn)行Sjbmi1基因的瞬時(shí)表達(dá)后，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR法檢測(cè)hbmi1基因的mRNA水平；提取總蛋白，WB法檢測(cè)hBMI1基因的蛋白水平。
　　 3、研究結(jié)論：
　　 3.1生物信息學(xué)分析、測(cè)

15、序及免疫血清學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)gb/EU912526.1序列為日本血吸蟲(chóng)SjBMI1的編碼基因，其ORF編碼354個(gè)氨基酸，具有環(huán)指保守功能域，在物種進(jìn)化過(guò)程具有保守性
　　 3.2構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-SjBMI1，并成功表達(dá)分子量約為43.5kD的重組蛋白rSjBMI1
　　 3.3Sjbmi1基因表達(dá)于日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵、雙性感染的成蟲(chóng)階段，且分布在成蟲(chóng)睪丸與卵巢，而單性感染的雌、雄成蟲(chóng)表達(dá)水平明顯降低，揭示該基