1、目的：
　　 本課題組的前期實(shí)驗(yàn)證明了丹參水提物能有效地防治糖皮質(zhì)激素引起的大鼠骨丟失;體外實(shí)驗(yàn)觀察到丹參水提物對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化能力有抑制作用,并能提高骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶的活性,刺激骨鈣素的分泌。但對(duì)其作用機(jī)制不明確。Wnt/β-catenin通路影響骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖、遷移,并調(diào)控其分化方向?；罨疻nt/β-catenin途徑能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,抑制脂肪細(xì)胞的分化與成熟。因

2、此,本研究通過觀察丹參水提物的主要有效成份丹參素與丹酚酸B對(duì)體外大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Marrowstromal stem cells,MSCs)成脂分化與成骨分化能力的影響,以探討丹參素與丹酚酸B對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分化方向的調(diào)節(jié)作用;通過觀察丹參素與丹酚酸B對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的關(guān)鍵基因Runx2,成脂分化過程的關(guān)鍵基因過氧化物酶增殖體激活受體γ(PPARγ),以及調(diào)控骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分化方向的Wnt/β-catenin信號(hào)通

3、路中的Dickkopf-1,β-catenin基因的影響,以探討丹參水提物丹參素與丹酚酸B對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化方向調(diào)控的作用機(jī)制。為中藥丹參作為抗骨質(zhì)疏松的新作用提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及成骨與成脂分化的鑒定
　　 通過傳代貼壁篩選的方法分離純化骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。應(yīng)用油紅染色法判斷是否成功誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞方向分化。應(yīng)用堿性磷酸酶染色法與茜素紅染色法判斷否成功誘導(dǎo)骨

4、髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化,并以此鑒定分離純化的骨髓基質(zhì)細(xì)胞中是否含有干細(xì)胞成分。
　　 2丹參素與丹酚酸B對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞分化方向的影響
　　 觀察不同濃度的丹參素與丹酚酸B對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成脂分化率及過氧化物酶增殖體激活受體γ(PPARγ)mRNA的影響,判斷藥物對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成脂分化能力的影響。檢測(cè)堿性磷酸酶的活性以及Runx2mRNA的表達(dá)以判斷藥物對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的影響

5、。并觀察丹參素與丹酚酸B作用的量效關(guān)系和找出它們?cè)趯?shí)驗(yàn)中的最佳作用濃度。
　　 3大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)在成骨與成脂分化誘導(dǎo)下的Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)節(jié)
　　 通過傳代貼壁篩選的方法分離純化骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,分別進(jìn)行成脂誘導(dǎo)與成骨誘導(dǎo)。應(yīng)用Wnt信號(hào)通路PCR芯片檢測(cè)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在成脂分化與成骨分化誘導(dǎo)后Wnt信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá),以分析和尋找與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞定向分化相關(guān)的靶基因。
　　 4丹

6、參素與丹酚酸B對(duì)調(diào)控大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化的Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵基因Dickkopf-1與p-catenin的影響
　　 選用純化的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,把細(xì)胞分成:陰性對(duì)照組、成脂誘導(dǎo)組、成骨誘導(dǎo)組、成脂誘導(dǎo)+丹參素組、成脂誘導(dǎo)+丹酚酸B組,丹參素組,丹酚酸B組,藥物作用后檢測(cè)細(xì)胞Dickkopf-1mRNA與β-catenin mRNA的表達(dá)。探討丹參素與丹酚酸B是否通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路

7、影響大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化方向。
　　 結(jié)果：
　　 1大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及成骨與成脂分化的鑒定
　　 通過傳代貼壁篩選的方法分離純化得到較為均一成纖維細(xì)胞型的骨髓基質(zhì)細(xì)胞。成骨誘導(dǎo)7后天堿性磷酸酶染色呈陽性,55天后骨結(jié)節(jié)茜素紅染色呈陽性;成脂誘導(dǎo)后出現(xiàn)個(gè)體增大的脂肪細(xì)胞,其脂滴可被油紅O染為紅色。說明分離的細(xì)胞具有干細(xì)胞特性,并能被定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞,可用于檢測(cè)藥物的作用。
　　

8、 2丹參素與丹酚酸B對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞分化的影響:
　　 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞用成骨誘導(dǎo)劑干預(yù)后堿性磷酸酶的表達(dá)較未誘導(dǎo)組明顯增加(p＜0.01)。成骨分化的關(guān)鍵基因Runx2mRNA表達(dá)也較未誘導(dǎo)組明顯增多。丹參素各個(gè)濃度在3天時(shí)無促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶的作用。濃度為5×10-6mol/L,5×10-7mol/L的丹參素與正常對(duì)照組相比,在第5天,7天能升高ALP的活性(P＜0.05)。丹酚酸B濃度為10-6m

9、ol/L與10-7mol/L時(shí)有促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分泌堿性磷酸酶的作用,該作用在藥物作用第三天時(shí)出現(xiàn),第5天和第7天時(shí)最明顯(P＜0.05)。濃度為5×10-7mol/L丹參素與濃度為10-7mol/L丹酚酸B與正常對(duì)照組組相比,均能增加Runx2mRNA的表達(dá),以丹參素作用明顯。添加脂肪誘導(dǎo)劑后rMSCs分化為脂肪細(xì)胞的能力比正常對(duì)照組明顯加強(qiáng)。油紅染色化學(xué)比色值(p＜0.01)及PPARγmRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加。成脂誘導(dǎo)

10、加藥組的成脂分化率比脂肪誘導(dǎo)組減少但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)比色值并未明顯增加。濃度為5×10-7mol/L丹參素與濃度為10-7mol/L丹酚酸B均能減少PPARγmRNA的表達(dá),以丹參素作用明顯。
　　 3大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)在成骨與成脂分化誘導(dǎo)下的Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)節(jié)
　　 通過傳代貼壁篩選的方法分離純化得到較為均一骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。經(jīng)誘導(dǎo)后可向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞方

11、向分化。在Wnt信號(hào)通路89個(gè)相關(guān)基因中,與未誘導(dǎo)組相比,骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后Wnt信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)的基因(Dkk-1、kremen、Fzd1)等15個(gè)(ratio＞2),下調(diào)的基因(sFrp5,β-catenin,Dvl3,Tct7)等16個(gè)(ratio＜0.5)。成骨誘導(dǎo)后Wnt信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)的基因(Dkk1,kremen,β-catenin,Wnt11)6個(gè)(ratio＞2),表達(dá)下調(diào)的基因(sFrp5,sFRP4,Fzdl

12、)等15個(gè)(ratio＜0.5)。
　　 4丹參素與丹酚酸B對(duì)調(diào)控大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化的Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵基因Dickkopf-1mRNA與β-cateninmRNA的影響。
　　 對(duì)照組、誘導(dǎo)組、和給藥組的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞均能表達(dá)Dickkopf-1與β-catenin mRNA。其中脂肪誘導(dǎo)組Dickkopf-1表達(dá)較對(duì)照組明顯增高,β-catenin則較對(duì)照組明顯下降。成骨誘導(dǎo)組則相反:Di

13、ckkopf-1較對(duì)照組表達(dá)明顯降低,β-catenin則較對(duì)照組明顯增多。脂肪誘導(dǎo)+丹參素組、脂肪誘導(dǎo)+丹酚酸B組的Dickkopf-1表達(dá)均比脂肪誘導(dǎo)組明顯減少,而β-catenin則比脂肪誘導(dǎo)組明顯增多。丹參素組、丹酚酸B組表達(dá)的Dickkopf-1比正常組少,同時(shí)丹參素組β-catenin的表達(dá)比正常組多,但丹酚酸B組β-catenin的表達(dá)比正常組少。
　　 結(jié)論：
　　 1丹參素與丹酚酸B均可促進(jìn)大鼠骨髓基質(zhì)

14、干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,增加MSCs的堿性磷酸酶活性,增加成骨分化關(guān)鍵基因Runx2mRNA的表達(dá)。丹參素和丹酚酸B同時(shí)使脂肪分化的關(guān)鍵基因PPARγmRNA表達(dá)減少,能使脂肪細(xì)胞脂滴減少。但不能減少脂肪細(xì)胞的數(shù)目。
　　 2大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在成骨分化與成脂分化過程中主要影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的Dickkopf-1基因。
　　 3丹參素通過減少Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的Dickkopf-1m