1、目的： 觀察肝細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞(Sertolicells，SCs)共微囊化腹腔移植，對(duì)急性肝功能衰竭(Acuteliverfailure，ALF)大鼠的治療作用，觀察不規(guī)則趨化因子(Fractalkine，F(xiàn)KN)在大鼠急性肝功能衰竭模型組及各干預(yù)治療組中的動(dòng)態(tài)變化并探討其變化的可能機(jī)制。 方法： 1.用改良的Seglen原位二步灌注法分離大鼠肝細(xì)胞，膠原酶胰酶消化法分離大鼠睪丸支持細(xì)胞，將肝細(xì)胞與SCs以20

2、:1的比例混合，以自制的微囊發(fā)生器制備含肝細(xì)胞或混合細(xì)胞的微囊。 2.D-氨基半乳糖(D-GalN)注入大鼠腹腔，建立大鼠急性肝功能衰竭模型。 3.ALF模型大鼠隨機(jī)分為四組：Ⅰ組為模型組：Ⅱ、Ⅳ、Ⅳ組分別為裸肝細(xì)胞組、微囊化肝細(xì)胞組和混合細(xì)胞共微囊化組。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組于ALF模型建立后18小時(shí)，分別向腹腔注射2ml裸肝細(xì)胞懸液、微囊化肝細(xì)胞懸液和共微囊化肝細(xì)胞睪丸支持細(xì)胞懸液。從每組中取出15只大鼠觀察生存率。

3、4.ALF模型組于造模后12、24、48、72、120和168h，其它三組于造模后24、48、72、120和168h，分別取6只大鼠，留血清標(biāo)本檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和總膽紅素(TB)；取肝組織用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)蛋白表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)FKNmRNA和NF-κBmRNA表達(dá)。另取6只大鼠作正常對(duì)照組。 結(jié)果： 1.每只大鼠平均肝細(xì)胞產(chǎn)量為(6.2

4、5±0.35)×107個(gè)，肝細(xì)胞存活率為(91.25±2.05)％。平均每只SD乳鼠睪丸組織消化后獲得支持細(xì)胞總數(shù)約為1×107個(gè)?？瘴⒛掖蠖喑蕡A形，直徑約400～800μm，表面光滑。包裹細(xì)胞后的微囊仍呈圓形，細(xì)胞懸浮于囊內(nèi)。 2.D-GalN誘導(dǎo)后12小時(shí)，血清ALT、AST顯著升高，與正常組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05.)；48小時(shí)達(dá)高峰。模型組TB從24小時(shí)至168小時(shí)均顯著高于正常水平(P＜0.05)。24

5、小時(shí)后HE染色示：肝細(xì)胞大片崩解壞死，肝索解離，小葉結(jié)構(gòu)模糊，殘存肝細(xì)胞水腫、變性。 3.從24到168小時(shí)，Ⅳ組ALT、AST水平均顯著低于Ⅰ組(P＜0.01)，Ⅳ組ALT從48到168小時(shí)與Ⅱ、Ⅲ組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ⅳ組AST在48和72小時(shí)與Ⅱ、Ⅲ組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ⅳ組TB在48、72、120和168小時(shí)與Ⅰ、Ⅱ組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在72、120和168小時(shí)與Ⅲ組差異有統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組生存率分別為26.7％、40.0％、66.7％、和86.7％。Ⅳ組生存率明顯高于其它三組(P＜0.05)。 4.肝組織FKNmRNA的表達(dá)在D-GalN誘導(dǎo)后12小時(shí)開始升高(P＜0.05)，至72小時(shí)達(dá)高峰，Ⅲ、Ⅳ組較Ⅰ組表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，從72到168小時(shí)，Ⅳ組與Ⅱ、Ⅲ組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Ⅰ組NF-κBmRNA在24小時(shí)顯著升高(P＜0.01)，至72

7、小時(shí)達(dá)高峰，Ⅱ組在24和48小時(shí)、Ⅳ組在24、48、72、120和168小時(shí)與Ⅰ組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，Ⅲ組在72、120和168小時(shí)NF-κBmRNA較Ⅱ組有明顯下降(P＜0.01)，從24至168小時(shí)Ⅳ組均較Ⅱ組下降顯著(P＜0.01)，而Ⅳ組與Ⅲ組在72和168小時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 5.NF-κB蛋白在正常大鼠肝組織中表達(dá)很少，D-GalN誘導(dǎo)后24小時(shí)顯著升高(P＜0.01)，至72小時(shí)

8、達(dá)高峰。Ⅱ、Ⅲ組在24和48小時(shí)，Ⅳ組在24到168小時(shí)NF-κB蛋白的表達(dá)明顯少于Ⅰ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Ⅲ組在72和120小時(shí)、Ⅳ組在72至168小時(shí)的NF-κB蛋白表達(dá)明顯少于Ⅱ組(P＜0.05)；Ⅳ組與Ⅲ組僅在168小時(shí)有顯著不同(P＜0.05)。 6.各組FKNmRNA的表達(dá)變化與NF-κBmRNA呈正相關(guān)(r=0.781，P＜0.01)，且二者與血清ALT均有相關(guān)性(r=0.827，P＜0.01和R=

9、0.952，p＜0.001)。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)中采用的胰酶加EDTA法分離的肝細(xì)胞，產(chǎn)量和活率均較高，且操作簡(jiǎn)單，易于多數(shù)實(shí)驗(yàn)室開展。 2.膠原酶和胰酶兩酶依次消化法分離大鼠睪丸支持細(xì)胞并用低滲處理法純化，可獲得較高產(chǎn)量和純度的支持細(xì)胞。 3.共微囊化肝細(xì)胞睪丸支持細(xì)胞腹腔移植治療，對(duì)于肝功能的改善作用及提高大鼠生存率方面明顯優(yōu)于裸肝細(xì)胞組和微囊化肝細(xì)胞組，是又一具有發(fā)展前景的急性肝功能衰竭替代治療手

10、段。 4.FKNmRNA在正常大鼠肝組織中不表達(dá)或表達(dá)很少，急性肝功能衰竭模型建立后12小時(shí)表達(dá)明顯增加，72小時(shí)達(dá)高峰，Ⅳ組FKNmRNA的表達(dá)明顯低于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，說(shuō)明FKN地電急性肝功能衰竭的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。 5.各組FKN的表達(dá)變化與NF-κB呈正相關(guān)，都是在模型組72小時(shí)達(dá)高峰，經(jīng)混合細(xì)胞共微囊化腹腔移植治療后，較Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組都顯著下降，表明FKN的變化可能與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，但尚須進(jìn)一步證實(shí)。