1、1.建立羅非魚肝細胞的分離及純化方法。 2.應用微囊化法對羅非魚肝細胞進行免疫隔離。 3.觀察微囊化羅非魚肝細胞移植對肝衰大鼠的治療作用。 4.探討魚綱與哺乳綱動物間肝細胞移植的可能性。材料和方法： 1.采用膠原酶冷消化法和兩步低速離心法分離羅非魚肝細胞。應用倒置顯微鏡和透射電鏡觀察羅非魚肝細胞形態(tài)及其超微結(jié)構(gòu)。采用臺盼藍拒染法檢測細胞活力。 2.D-GaIN(D-galactosamine，D-

2、氨基酸半乳糖鹽酸鹽)大鼠腹腔內(nèi)注射，建立急性藥物性肝衰模型。 3.采用ACA(Aginate-Chitosan-ginate，海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉)微囊包裹羅非魚肝細胞移植入肝衰大鼠模型腹腔內(nèi)，即微囊化羅非魚肝細胞移植組(簡稱微囊化組，N=35只)；并設(shè)立空微囊移植組(空微囊組，N=28只)、裸肝細胞移植組(裸肝細胞組，N=35只)及NS(Normal saline，生理鹽水)對照組(NS組，N=28只)等作為實驗對照。

3、 4.比較移植后各組肝衰大鼠的一周存活率；于移植后24h和48h分別取各組存活大鼠5只經(jīng)腹主動脈取血作肝功能檢測，觀察谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素和白蛋白的變化；分別在24h、48h、7d和14d時間點上對移植物進行光鏡和電鏡的病理檢查。 結(jié)果： 1.平均每條魚獲得0.93±0.22×108個肝細胞，臺盼藍染色示肝細胞活率為90.1±0.79％，純度為89.75±1.92％。光鏡F新分離的肝細胞呈透亮圓球形，形態(tài)大小一致，

4、少數(shù)聚集成團。透射電鏡示羅非魚肝細胞細胞質(zhì)內(nèi)可見大量圓形或卵圓形線粒體和糖原顆粒；粗面及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多；細胞核形狀較為規(guī)則，大而圓，核仁清晰。 2.制備好的空微囊多為圓形，邊緣清晰，內(nèi)部為透明凝膠液體，外部膜結(jié)構(gòu)完整。包裹肝細胞大部分居于微囊內(nèi)部，僅有少量肝細胞貼于囊壁上。 3.移植后受體一周存活率比較：微囊化組受體一周存活率為，57.9％明顯高于裸肝細胞組(21.1％，P<0.05)；與空微囊組(16.7％)、生理鹽

5、水組(16.7％)比較亦有顯著性差異(P<0.05)；而裸肝細胞組、空微囊組和生理鹽水組三組組間比較差異不顯著(P>0.05)。 4.移植48h后受體肝功能檢測：(1)微囊化肝細胞組AIT為1103.9±132.4U/L，明顯低于裸肝細胞組(2188.3±185.4U/L，P<0.01)；與空微囊組(2257.8±283.3U/L)、生理鹽水組(2379.2±168.7U/L)比較亦有顯著性差異(P<0.01)；而裸肝細胞組、空

6、微囊組和生理鹽水組三組組間比較差異不顯著(P>0.05.)。(2)微囊化肝細胞組TBlL為6.21±0.86μmol/L，明顯低于裸肝細胞組(9.18±0.96μmol/L.P<0.05)；與空微囊組(8.82±0.93μmol/L)、生理鹽水組(8.76±0.7μmol/L)比較亦有顯著性差異(P<0.05)；而裸肝細胞組、空微囊組和生理鹽水組三組組間比較差異不顯著(P>0.05)。(3)微囊化肝細胞組ALB為3.2±1.14g/L，

7、明顯低于裸肝細胞組(21.0±1.98g/L，P<0.05)；與空微囊組(20.6±1.34g/L)、生理鹽水組(19.3±1.22 g/L)比較亦有顯著性差異(P<0.05)；而裸肝細胞組、空微囊組和生理鹽水組三組組間比較差異不顯著(P>0.05)。 5.各組移植物病理檢查：裸肝細胞在移植后48h即可見腹腔內(nèi)有較多白色團塊粘附于大網(wǎng)膜上，收集移植物組織HE染色后光鏡檢查可見腹膜將移植的裸肝細胞包裹為細胞團塊，周圍大量炎癥細胞浸

8、潤，肝細胞多己變性壞死；而微囊化組在移植后48h，可從受體腹腔中收集到形態(tài)完整的微囊，其內(nèi)肝細胞活力良好，臺盼藍染色示肝細胞活率可達到80％。 移植后7d，微囊化組受體腹腔內(nèi)可見到形態(tài)完整、無明顯粘連的微囊。其內(nèi)肝細胞存活良好，將微囊壓碎后，肝細胞臺盼藍染色活力達45.3±5.8％。透射電鏡觀察可見微囊內(nèi)羅非魚肝細胞結(jié)構(gòu)正常，細胞核形狀較為規(guī)則。 移植后14天大體觀察見含羅非魚肝細胞的微囊主要粘附于腸壁、網(wǎng)膜、肝臟下緣和

9、側(cè)腹壁，少量微囊粘聚成團，周圍可見血管形成。將微囊壓碎后，肝細胞臺盼藍染色活力仍可達34.7±4.0％。 結(jié)論： 1.膠原酶冷消化法分離的羅非魚肝細胞形態(tài)完整、活性良好，產(chǎn)量和純度均較高，是一種較好的分離方法。 2.移植后羅非魚肝細胞能在微囊內(nèi)較長期存活，具有較強的耐低氧能力。 3.ACA微囊可起到良好的免疫隔離作用，有利于移植物的長期存活，并且其具有較好的生物相容性，較為有效的避免了囊周纖維化的發(fā)生。