1、鵝副黏病毒病是由鵝源副黏病毒(Goose Paramyxovirus，GPMV)引起的鵝的一種急性、烈性傳染病，具有較高的發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)鵝業(yè)帶來了嚴(yán)重的危害。 目前，臨床上對(duì)GPMV感染尚無特效的治療藥物，接種疫苗是預(yù)防和控制該病發(fā)生的主要手段。應(yīng)用傳統(tǒng)的活疫苗和油乳滅活疫苗不能產(chǎn)生足夠的免疫保護(hù)。滅活疫苗免疫不能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)的產(chǎn)生。CTL是有效的免疫效應(yīng)

2、細(xì)胞，在抗病毒中起著重要的作用。隨著分子生物學(xué)等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，如何利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)基因工程疫苗來預(yù)防和控制該病成為一項(xiàng)迫在眉睫的問題。 鵝源副黏病毒研究表明，GPMV為有囊膜單鏈負(fù)股不分節(jié)段RNA病毒，由6種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組成：NP(核衣殼蛋白)、P(磷蛋白)、M(基質(zhì)蛋白)、F(融合蛋白)、HN(血凝素.神經(jīng)氨酸酶蛋白)、L(高分子量的RNA聚合酶)，其中，F(xiàn)蛋白和HN蛋白是該病毒的主要保護(hù)性抗原。因此，構(gòu)建含有主要保護(hù)性抗

3、原基因F或HN基因的真核表達(dá)載體，對(duì)預(yù)防該病具有重要意義。 本研究根據(jù)GenBank中發(fā)表的GPMV HN基因的開放閱讀框架(openreading fram,ORF)序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物。從鵝源副黏病病死的鵝體內(nèi)分離到GPMV(命名為GPMV JAU04株)，接種9日齡SPF雞胚，待24小時(shí)后獲取死亡雞胚的尿囊液，檢測(cè)病毒液的血凝集效價(jià)為2<'8>。利用 TRIZOL 法提取病毒的RNA，用RT-PCR方法成功的擴(kuò)增了

4、該病毒的主要保護(hù)性抗原HN基因。將擴(kuò)增片段連接于pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌 JM-109中，大量培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，通過限制性內(nèi)切酶及PCR的方法篩選陽性重組質(zhì)粒，再進(jìn)行序列測(cè)定(GenBank登陸號(hào)為EF141104)。序列分析結(jié)果表明，GPMV JAU04分離株HN基因由ATG到TAA共1 716個(gè)核苷酸，編碼571個(gè)氨基酸，有5個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，12個(gè)保守的半胱氨酸(Cys)殘基。與國內(nèi)所發(fā)表的鵝源副黏病毒和其他國內(nèi)外

5、參考標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)弱毒株的同源性為81.9％～99.4％，推導(dǎo)氨基酸的同源性為88.6％～98.8％。分別用限制性內(nèi)切酶Kpn Ⅰ和HindⅢ酶切pMD-18HN和真核表達(dá)載體pVAXI，將純化回收的HN基因成功克隆入帶有粘性末端的真核表達(dá)載體pVAXI，構(gòu)建了含有HN基因的真核表達(dá)載體pVAXI-HN。通過脂質(zhì)體法把pVAXI-HN轉(zhuǎn)染入Vero細(xì)胞進(jìn)行真核表達(dá)。經(jīng)過細(xì)胞的培養(yǎng)，提取細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，以P1/