1、乳酸桿菌是人和動(dòng)物消化道和生殖道中的正常微生物菌群之一,可通過(guò)生物拮抗、改善菌群生態(tài)平衡和提高機(jī)體免疫功能等方面在動(dòng)物生產(chǎn)中發(fā)揮其益生素作用。S-層蛋白(S-layer protein)是許多細(xì)菌表面的主要蛋白成分,分子量為40-200 kDa,占菌體總蛋白的10-15％,一般為弱酸性(pI為4-6)。乳酸桿菌S-層蛋白是目前最小的已知S-層蛋白,分子量在25-71 kDa之間,為堿性(pI＞9)。只有少數(shù)乳酸桿菌S-層蛋白的結(jié)構(gòu)已經(jīng)清

2、楚,但大部分功能尚不清楚。國(guó)內(nèi)對(duì)于乳酸桿菌S-層蛋白基因的表達(dá)、蛋白功能及應(yīng)用等方面鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)系列體外試驗(yàn)探討了豬腸道分離株卷曲乳酸桿菌(Lactobacillus crispatus)ZJ001的益生素樣作用、編碼S-層蛋白的基因結(jié)構(gòu)以及與細(xì)菌細(xì)胞錨定和宿主細(xì)胞粘附功能相關(guān)的S-層蛋白功能域。
　　 L.crispatus ZJ001對(duì)強(qiáng)酸和膽汁具有較強(qiáng)的抵抗力,對(duì)HeLa細(xì)胞的粘附力、對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmon

3、ella typhimurium)和大腸桿菌(Escherichia coli)O157:H7體外生長(zhǎng)和粘附力的拮抗作用與參考菌株ATCC4356相比更強(qiáng)。ZJ001株對(duì)S.typhimurium和E coli O157:H7體外生長(zhǎng)的抑制作用主要是由于分泌大量乳酸等酸性物質(zhì)導(dǎo)致培養(yǎng)環(huán)境的pH下降所引起。ZJ001株對(duì)S.typhimurium和E.coli O157:H7粘附力的拮抗作用則與它的強(qiáng)粘附能力相關(guān),其對(duì)HeLa細(xì)胞的粘附率

4、為88.9％,顯著高于ATCC4356的15.0％(P＜0.01)。這些結(jié)果表明L.crispatusZJ001可作為益生素菌株而應(yīng)用于預(yù)防腸道疾病。
　　 L.crispatus ZJ001表面存在約42kDa的S-層蛋白,該蛋白可用鹽酸胍和LiCl處理獲得,并對(duì)蛋白酶K敏感,細(xì)菌連續(xù)傳代不影響該蛋白的表達(dá)。利用LiCl除去后,培養(yǎng)8 h左右又能在細(xì)菌表面重新形成。LiCl除去S-層蛋白后,ZJ001株的自凝現(xiàn)象和對(duì)HeLa細(xì)

5、胞的粘附力降低,而抗S-層蛋白多克隆抗體對(duì)ZJ001株粘附力的抑制作用進(jìn)一步證明了S-層蛋白在粘附過(guò)程中的重要性。ZJ001株能競(jìng)爭(zhēng)和排除地抑制S.typhimurium和E.coli O157:H7對(duì)HeLa細(xì)胞的粘附力,但不能顯著置換已粘附到細(xì)胞上的病原菌。LiCl除去S-層蛋白后,ZJ001對(duì)病原菌粘附力的拮抗作用降低,對(duì)E.coli O157:H7拮抗作用的影響更為明顯。此外,S-層蛋白對(duì)E.coli O157:H7粘附力的拮抗

6、作用比對(duì)S.typhimurium更強(qiáng),100μg S-層蛋白對(duì)E.coli O157:H7與HeLa細(xì)胞的粘附力降低幅度可達(dá)87％,但對(duì)S.typhimurium的抑制率僅為21.2％。以上結(jié)果表明S-層蛋白參與了L.crispatusZJ001的粘附過(guò)程,并能拮抗病原菌的粘附。
　　 L.crispatus ZJ001具有兩個(gè)S-層蛋白基因slpA和slpB,這兩個(gè)基因編碼的蛋白都具有乳酸桿菌S-層蛋白的典型特征。slpA基

7、因全長(zhǎng)1329bp,編碼442個(gè)氨基酸殘基,其中N端的30個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列。slpA成熟蛋白的分子量為44.3kDa,等電點(diǎn)為9.57。slpB基因全長(zhǎng)1386bp,編碼461個(gè)氨基酸殘基,其中N端30個(gè)氨基酸也為信號(hào)肽序列。slpB成熟蛋白的分子量為45.1kDa,等電點(diǎn)為9.57。slpA和slpB成熟蛋白的氨基酸組成和含量很相似,疏水性氨基酸、帶電荷的氨基酸和極性氨基酸含量都很高,但都沒(méi)有含硫的氨基酸殘基。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明

8、slpA蛋白由37％的α-螺旋和49.7％的β-折疊組成,而slpB由27.9％的α-螺旋和58.9％的β-折疊組成。兩個(gè)成熟蛋白的氨基酸同源性為47％,其中C端同源性高達(dá)87％,但N端和中間區(qū)域的同源性卻只有30％,與其他乳酸桿菌S-層蛋白的同源性也集中在C端(77-95％之間),N端的變異較大。其中slpA蛋白與L.crispatus JCM5810 CbsA蛋白的同源性最高(82％)。Western blot和間接ELISA結(jié)果表

9、明slpA和slpB之間存在交叉反應(yīng)。與從ZJ001株表面提取的S-層蛋白不同,slpA的E.coli表達(dá)產(chǎn)物自身裝配成片狀的類(lèi)結(jié)晶結(jié)構(gòu),slpB卻形成了圓盤(pán)樣結(jié)構(gòu)。盡管slpA和slpB兩個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)不同,但均能粘附HeLa細(xì)胞。
　　 長(zhǎng)距離PCR和序列分析結(jié)果表明slpA和slpB位于長(zhǎng)約9.0kb的slp片段上,間隔約為4.5kb。只有slpA基因上游有一啟動(dòng)子結(jié)構(gòu),而slpB基因?yàn)榉聪蛐蛄星疑嫌螞](méi)有啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)。RT-P

10、CR、Western blot和間接ELISA結(jié)果進(jìn)一步證明了只有slpA在L.crispatus ZJ001中得到了轉(zhuǎn)錄和表達(dá),并在細(xì)菌表面形成了S-層結(jié)構(gòu)。slpA和slpB基因在5’端存在同源區(qū),slpB基因可能通過(guò)位置的互換而轉(zhuǎn)換到slpA啟動(dòng)子的下游,并且這一現(xiàn)象已在L.acidophilus ATCC4356中得到了證實(shí)。L.crispatus ZJ001在需氧和厭氧環(huán)境中形成三種不同的菌落形態(tài),即粗糙型、光滑型和扁平型,但

11、這三種菌落中,都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)slpA和slpB基因位置顛換的情況,RT-PCR只能檢測(cè)到slpA基因的轉(zhuǎn)錄,而SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)這三種不同類(lèi)型菌落的細(xì)菌表面都存在S-層蛋白。以上結(jié)果表明,培養(yǎng)環(huán)境中的氧濃度不能引起slpA和slpB基因位置的顛換,也不能誘導(dǎo)slpB的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　 根據(jù)氨基酸組成和同源性分析,L.crispatus ZJ001 slpA蛋白具有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域,即SAN和SAC,其中SAN(1-290aa)

12、由親水性和疏水性氨基酸交替組成,而SAC(291-412aa)主要由親水性氨基酸組成,且堿性氨基酸的含量也很高。為了進(jìn)一步闡明SAN和SAC的功能,將它們分別和eGFP進(jìn)行融合表達(dá)和純化,結(jié)果表明:SAN-eGFP能和抗S.層蛋白多克隆抗體反應(yīng),并能粘附到HeLa細(xì)胞表面:eGFP-SAC與抗S-層蛋白多克隆抗體的反應(yīng)較弱,能錨定到經(jīng)LiCl除去S-層蛋白后的L.crispatus ZJ001和L.acidophilus ATCC435

13、6的細(xì)胞外膜上,并能錨定到干酪乳酸桿菌(Lactobacillus casei)M4的細(xì)胞壁上,但不能錨定未經(jīng)處理的L.crispatus ZJ001和L.acidophilus ATCC4356以及約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)R20的細(xì)胞外膜上。以上結(jié)果表明SAN與slpA蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的粘附作用有關(guān),而SAC主要參與slpA蛋白在L.crispatus ZJ001外膜上的錨定。
　　 本試驗(yàn)