1、目的：細(xì)胞粘附分子極遲抗原4(VLA-4)在炎癥中介導(dǎo)白細(xì)胞的粘附和滲出、是目前國際公認(rèn)的抗炎藥物的新靶點(diǎn)，LDV(Leu-Asp-Val)是其配體纖維粘連蛋白(FN)與之結(jié)合的關(guān)鍵序列。近年來，以LDV序列為基礎(chǔ)的小分子肽類拮抗劑的開發(fā)，已經(jīng)成為國際上抗炎藥物研究的熱點(diǎn)之一。但是，與其它小分子肽類藥物的性質(zhì)相似，VLA-4的LDV類小分子拮抗肽由于分子量小，易被酶解破壞和清除，體內(nèi)半衰期極短。 聚乙二醇(PEG)是一類具有良好

2、生物相容性的無毒無活性的聚醚高分子化合物，經(jīng)PEG修飾可以增加蛋白質(zhì)及肽的酶解穩(wěn)定性、延長血漿衰期、增強(qiáng)生物利用度、提高藥物療效和安全性。自20世紀(jì)90年代以來，已經(jīng)有多個聚乙二醇修飾的蛋白類藥物在美國經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市，但聚乙二醇修飾肽類藥物的研究國外和國內(nèi)均剛剛起步，資料很少。 本項研究采用分子量為2000的單甲氧基聚乙二醇修飾LDV及其衍生物KILDVA肽，并進(jìn)行體外和體內(nèi)的抗炎免疫藥理活性分析，以初步探討聚乙二醇修飾VLA

3、-4的LDV類小分子拮抗肽類藥物的可行性，為進(jìn)一步的具有較長血漿半衰期和生物學(xué)活性等良好藥效和藥代動力學(xué)特征的、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的、PEG修飾的VLA-4拮抗肽類新型抗炎藥物的開發(fā)研究提供基本的實驗方法和實驗數(shù)據(jù)支持，并為肽類藥物的聚乙二醇修飾研究提供基本的技術(shù)方法、構(gòu)建技術(shù)平臺。 方法： 1.合成設(shè)計合成產(chǎn)物1結(jié)構(gòu)：Leu-Asp-Val，為被修飾短肽。合成產(chǎn)物2結(jié)構(gòu)：Lys-Ile-Leu-Asp-Val-Ala，為

4、被修飾短肽，設(shè)計參考Tamraz所合成的環(huán)肽。環(huán)肽的基本結(jié)構(gòu)為兩段KILDVA首尾相連，已證實具有良好的生物活性。合成產(chǎn)物3結(jié)構(gòu)：mPEG2000-NHCOCH2CH2COOH-Leu-Asp-Val，為Leu-Asp-Val的PEG修飾物。合成產(chǎn)物4結(jié)構(gòu)：mPEG2000-NHCOCH2CH2COOH-Lys-Ile-Leu-Asp-Val-Ala，為Lys-Ile-Leu-Asp-Val-Ala的PEG修飾物。 其中合成產(chǎn)物

5、3、4的PEG修飾位點(diǎn)設(shè)計于被修飾肽的N-末端，基本意圖是保LDV肽配體結(jié)合活性的關(guān)鍵氨基酸殘基Asp不被修飾物屏蔽。 2.肽合成及其PEG修飾采用Fmoc固相法，以wang樹脂為載體，依次進(jìn)行保護(hù)氨基酸的縮合反應(yīng)，經(jīng)肽樹脂裂解，Sephadex凝膠脫鹽和HPLC純化后，得到純度較高的合成肽Leu-Asp-Val和Lys-Ile-Leu-Asp-Val-Ala。 Fmoc固相法制備以上合成肽，以活化的mPEG2000對L

6、eu-Asp-Val和Lys-Ile-Leu-Asp-Val-Ala的N端進(jìn)行修飾，同上方法經(jīng)肽樹脂裂解，Sephadex凝膠脫鹽和HPLC純化后，得到純度較高的mPEG2000-NHCOCH2CH2COOH-Leu-Asp-Val和mPEG2000-NHCOCH2CH2COOH-Lys-Ile-Leu-Asp-Val-Ala。 對以上合成和修飾產(chǎn)物進(jìn)行HPLC和MS分析鑒定。3合成產(chǎn)物的的抗炎免疫藥理活性分析采用卵白蛋白(OV

7、A)霧化吸入誘發(fā)制備豚鼠過敏性哮喘模型。制模豚鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半。其中LDV、KILDVA、mPEG2000-LDV和mPEG2000-KILDVA治療組豚鼠分別于制模第15天開始，腹腔注射受試合成或修飾產(chǎn)物5mg/kg，空白和陽性藥物對照組豚鼠分別腹腔注射生理鹽水2ml或地塞米松10mg/kg，每日1次，連續(xù)7天。末次給藥后一小時，各組豚鼠OVA霧化吸入引喘，測定引喘潛伏期和引喘后跌倒率；戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉豚鼠，

8、4℃D-Hank液5ml支氣管灌洗，percoll液分離灌洗液中的嗜酸性粒細(xì)胞，計數(shù)；使用48孔細(xì)胞趨化反應(yīng)盒觀察合成產(chǎn)物對嗜酸性粒細(xì)胞的趨化抑制作用；進(jìn)行嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶(EPO)活性測定；肺組織以10％甲醛固定，進(jìn)行病理學(xué)組織學(xué)檢查。 采用Wistar大鼠人工造囊，觀察適宜濃度合成及修飾產(chǎn)物作用7.5小時，對大鼠經(jīng)CMC刺激白細(xì)胞游出的影響。 結(jié)論： 1.本實驗采用的Fmoc固相多肽合成以及聚乙二醇修飾

9、方法反應(yīng)條件溫和，合成產(chǎn)物純度較高，重復(fù)性良好，MS檢測合成產(chǎn)物分子量與預(yù)期相符，質(zhì)量可控。 2.LDV和KILDVA肽及其PEG修飾產(chǎn)物mPEG2000-LDV、mPEG2000-KILDVA對嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有明顯的拮抗活性，PEG修飾產(chǎn)物的生物利用度增加。實驗初步達(dá)到了預(yù)期充分暴露配體結(jié)合部位、保留原化合物藥理活性的合成目的。 3.LDV和KILDVA肽及其PEG修飾產(chǎn)物mPEG2000-LDV、mPEG

10、2000-KILDVA對實驗性哮喘豚鼠肺泡、支氣管HEos、NEos的滲出抑制作用無明顯的選擇性。 4.LDV和KILDVA肽及其PEG修飾產(chǎn)物mPEG2000-LDV、mPEG2000-KILDVA對嗜酸性粒細(xì)胞在到達(dá)炎癥部位后的活化和EPO等炎癥介質(zhì)的釋放過程無明顯影響。 5.LDV和KILDVA肽及其PEG修飾產(chǎn)物mPEG2000-LDV、mPEG2000-KILDVA對炎癥過程中中性粒細(xì)胞的粘附和滲出無明顯影響。