1、研究背景：膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。其發(fā)生率在所有腫瘤中男性為第4位，女性為第8位。表淺性膀胱癌首選采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)進(jìn)行治療。而若僅行電切術(shù)，有50-70％患者將在術(shù)后一年內(nèi)復(fù)發(fā)。 由于膀胱癌的高發(fā)病率和高復(fù)發(fā)率，人們投入了大量的精力研究膀胱腫瘤，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是基礎(chǔ)和臨床之間的重要過(guò)渡環(huán)節(jié)，研究人員通過(guò)建立膀胱腫瘤動(dòng)物模型來(lái)研究膀胱癌的病因、病理和生物學(xué)行為，評(píng)價(jià)療效等，為臨床治療和預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。因此，

2、建立一個(gè)良好的動(dòng)物模型就顯得尤其重要。自1969年Rygaard等首次將人類腫瘤成功的移植于裸小鼠以來(lái)，大多數(shù)類惡性腫瘤均已在裸小鼠體內(nèi)建立了移植瘤模型，就其移植途徑而言，多采取皮下接種方式，雖然這種移植方法簡(jiǎn)單易行，腫瘤的生長(zhǎng)情況也便于觀察，且在一定程度上也近似的模擬了原有腫瘤的形態(tài)學(xué)、生物學(xué)及生物化學(xué)特性。然而，對(duì)于大多數(shù)人類惡性腫瘤來(lái)說(shuō)，接種于裸小鼠皮下組織是屬于異位移植，脫離了其起源組織器官的微環(huán)境，因此在實(shí)驗(yàn)中移植瘤的某些行為

3、常不同于原先患者身上的惡性腫瘤的生物學(xué)行為，如移植瘤常有包膜、呈局限性生長(zhǎng)、很少發(fā)生局部或遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移，故未能很好的被應(yīng)用于研究人癌癥潛在的侵襲與轉(zhuǎn)移特性。 自從1977年Tan等將小鼠結(jié)腸癌成功的原位接種于同基因小鼠的結(jié)腸壁上的報(bào)道中得到啟示后，越來(lái)越多的學(xué)者探索了這一新的腫瘤移植方法—原位移植(Orthotopictransplantation)，也即是將人類腫瘤接種到與腫瘤原發(fā)部位相對(duì)應(yīng)的移植宿主器官組織內(nèi)，使其獲得與人

4、體腫瘤相似的微環(huán)境。這一原位移植方式克服了上述所提到的異位移植存在的一些缺點(diǎn)，從而為研究人類惡性腫瘤尤其是其侵襲與轉(zhuǎn)移的惡性生物學(xué)特性的研究提供了更為適宜的動(dòng)物模型。 目的：采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法，將綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)標(biāo)記于人膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞株中，使T24細(xì)胞可以長(zhǎng)期、穩(wěn)定的攜帶綠色熒光蛋白。再將轉(zhuǎn)染后的人膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞(文中稱T24/GFP細(xì)胞)

5、采用懸液注射法注射于裸小鼠膀胱壁內(nèi)建立可在活體熒光整體成像系統(tǒng)下直接觀察腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的簡(jiǎn)便、可靠的原位移植模型。 方法：以綠色熒光蛋白作為標(biāo)記基因?qū)肴祟惏螂滓菩屑?xì)胞癌T24細(xì)胞株中，經(jīng)梯度濃度G418篩選及多次單克隆培養(yǎng)獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。常規(guī)消毒裸小鼠后取下腹正中切口，找到膀胱，將膀胱輕拉出腹腔，輕輕擠壓使其排尿致膀胱空虛膀胱壁增厚，用4號(hào)針頭采用懸液注射法直接向膀胱壁內(nèi)注射不含血清的50μlT2

6、4/GFP細(xì)胞懸液(約5×105個(gè))，需注意勿穿透膀胱壁，活體熒光成像系統(tǒng)下隔天直接觀察腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。 結(jié)果：經(jīng)綠色熒光蛋白標(biāo)記的人膀胱腫瘤T24細(xì)胞在熒光顯微鏡下發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，并可在體內(nèi)、外持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)且可穩(wěn)定傳代而熒光無(wú)明顯衰減。在細(xì)胞普通培養(yǎng)中，T24/GFP細(xì)胞與T24細(xì)胞均需隔天換液，顯微鏡下均呈橢圓形或圓梭形，單層貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞間界限清楚，持續(xù)生長(zhǎng)3個(gè)月后仍能高水平表達(dá)GFP而細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)速度無(wú)明顯變化。

7、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染前后T24細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度無(wú)明顯差異。膀胱原位接種5×105個(gè)轉(zhuǎn)染后的膀胱腫瘤細(xì)胞后，1周時(shí)全部可觸及小包塊并可在熒光下清楚的觀察到腫瘤大小，2周時(shí)腫瘤生長(zhǎng)加快，到4周時(shí)通?？蛇_(dá)1.5×1.5cm大小，荷瘤裸小鼠通常在6～7周時(shí)死亡。熒光鏡下觀察未見(jiàn)肝、肺、腎、脾和淋巴結(jié)明顯的腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的熒光，普通病理切片亦未見(jiàn)上述組織器官有轉(zhuǎn)移跡象。皮下接種未轉(zhuǎn)染GFP的T24腫瘤細(xì)胞的裸小鼠除了無(wú)熒光顯示外，成瘤時(shí)間、腫瘤