1、肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是各種不同致病因子引起慢性肝病進(jìn)而發(fā)展為肝硬化的共有病理改變和必經(jīng)途徑，是肝臟對(duì)各種慢性損傷產(chǎn)生的一種修復(fù)反應(yīng)。其主要病理改變是細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度合成與異常沉積。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)是肝臟主要的纖維生成細(xì)胞，其活化后可在肝損傷部位移行、增殖，表達(dá)各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，產(chǎn)生大量以膠原為主的ECM成分

2、和細(xì)胞因子，是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。隨著對(duì)肝纖維化發(fā)病機(jī)制的深入研究，如何抑制HSC活化、增殖，進(jìn)而減少ECM合成，已成為目前阻斷甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要策略。
　　 第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因(phosphatase andtensin homology deleted on chromosome Ten，PTEN)是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，可負(fù)性調(diào)控腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、

3、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其缺失或表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　 近年來，對(duì)PTEN的研究已從腫瘤領(lǐng)域逐漸延伸到非腫瘤領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，特異性肝細(xì)胞PTEN缺失不僅引起肝細(xì)胞癌，還導(dǎo)致與肝纖維化密切相關(guān)的非酒精性肝炎的發(fā)生。而我們的前期研究表明，在膽總管結(jié)扎肝纖維化大鼠肝組織中PTEN蛋白及mRNA表達(dá)均低于正常大鼠肝組織并與在體HSC的活化、增殖呈顯著負(fù)相關(guān)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的PTEN可顯著抑制體外活化HSC的增殖、

4、誘導(dǎo)其凋亡，并且PTEN過表達(dá)可通過下調(diào)活化HSC的cyclinD1、CDK4蛋白及其mRNA表達(dá)，上調(diào)P27kipl蛋白及其mRNA表達(dá)負(fù)性調(diào)控活化HSC的細(xì)胞周期進(jìn)程。但PTEN低表達(dá)對(duì)體外活化HSC細(xì)胞周期的影響仍不清楚。
　　 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是目前最有效的基因沉默技術(shù)，能特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而下調(diào)相應(yīng)蛋白水平及功能。為此，我們?cè)谇捌谘芯康幕A(chǔ)上，構(gòu)建了靶向PTEN的RNA干

5、擾重組腺病毒(Ad-siRNA/PTEN)，并在體外感染活化的大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6，觀察阻斷PTEN表達(dá)對(duì)活化HSC細(xì)胞周期的影響，從反面探討PTEN在調(diào)控HSC生物學(xué)行為中的作用，以期從細(xì)胞周期角度揭示PTEN調(diào)控HSC增殖的機(jī)制，從而為尋找抗肝纖維化治療的有效新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。
　　 目的：采用RNAi技術(shù)，以腺病毒為載體，構(gòu)建靶向PTEN的RNA干擾重組體，觀察阻斷PTEN表達(dá)對(duì)活化HSC細(xì)胞周期的影響及其

6、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法：利用AD293T細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)所需的腺病毒(Ad-SiRNA/PTEN、Ad-EGFP)，熒光顯微鏡檢測(cè)病毒滴度，并在體外感染活化的大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6。實(shí)驗(yàn)分組如下：①Control組，僅以含8％胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染步驟加入無血清無抗生素DMEM代替病毒液；②Ad-EGFP組，轉(zhuǎn)染表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced greenfluorescent protein

7、，EGFP)的空病毒Ad-EGFP;⑧Ad-siRNA/PTEN組，轉(zhuǎn)染靶向PTEN的RNA干擾序列并表達(dá)EGFP的重組腺病毒Ad-siRNA/PTEN。
　　 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定HSC細(xì)胞周期時(shí)相；Western blot檢測(cè)HSC的PTEN、細(xì)胞周期素D1(cyclinD1)、細(xì)胞周期素依賴性激酶4(cyclin dependentkinase4，CDK4)、細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子(cyclin dependent kin

8、aseinhibitor，CDI)之一的P27kipl、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B(serine-threonineprotein kinase B，Akt)、p-Akt(Thr308)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulated kinase，ERK)及p-ERK蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：①通過反復(fù)感染AD293T細(xì)胞的方法使病毒擴(kuò)增獲得了實(shí)驗(yàn)所需的病毒液(Ad-siRNA/PTEN、Ad-

9、EGFP的滴度分別為1.1×109pfu/mL、1.2×109pfu/mL)。②腺病毒感染HSC后，應(yīng)用Western blot分析隨感染時(shí)間延長，HSC內(nèi)PTEN蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)，結(jié)果顯示，在0h、24h、48h及72h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)分別為2.46±0.06、1.78±0.04、1.43±0.12及0.79±0.14(P＜0.01)。在感染后72h，同Ad-EGFP組(1.18±0.05)相比，Ad-siRNA/PTEN組(

10、0.43±0.02)PTEN蛋白表達(dá)顯著降低，P＜0.01;而Control組(1.23±0.17)與Ad-EGFP組之間無明顯差異（P＞0.05）。③流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，HSC細(xì)胞數(shù)G0/G]期所占比例，Ad-siRNA/PTEN組(57.70％±4.37％)較Control組（68.13％±1.00％）及Ad-EGFP組（69，57％±2.15％）明顯降低(P＜0.01)；S期所占比例，Ad-siRNA/PTEN組（30.70％

11、±5.13％）較Control組（13.13％±1.78％）及Ad-EGFP組(12.37％±1.33％)明顯增高(P＜0.01);G2/M期所占比例，Ad-siRNA/PTEN組（11.60％±2.72％）低于Control組（18.73％±2.78％）及Ad-EGFP組(18.40％±2.79％)(P＜0.01);Control組與Ad-EGFP組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0，05）。④腺病毒感染HSC后72h，Western bl

12、ot分析各組HSCcyclinD1蛋白表達(dá)，Ad-siRNA/PTEN組(2.78±0.18)較Control組(1.93±0.12)及Ad-EGFP組(1.87±0.03)顯著增高(P＜0.01)；而Control組與Ad-EGFP組之間無明顯差異(P＞0.05）。⑤腺病毒感染HSC后72h，Western blot檢測(cè)各組HSC CDK4蛋白表達(dá)，Ad-siRNA/PTEN組(0.49±0.01)較Control組(0.41±0.0

13、1)及Ad-EGFP組(0.39±0.02)增加(P＜0.01);Control組與Ad-EGFP組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。⑥腺病毒感染HSC后72h，Westernblot分析各組HSC P27kipl蛋白表達(dá)，Ad-siRNA/PTEN組(1.57±0.03)低于Control組(1.91±0.03)及Ad-EGFP組(1.95±0.02)，P＜0.01;Control組與Ad-EGFP組之間無明顯差異（P＞0.05）

14、。⑦腺病毒感染HSC后72h，Westernblot分析各組HSC Akt蛋白表達(dá)，Ad-siRNA/PTEN組(2.71±0.22)低于Control組（3.4±0.16）及Ad-EGFP組(3.39±0.38)，P＜0.01;Control組與Ad-EGFP組之間無明顯差異(P＞0.05）。⑧腺病毒感染HSC后72h，Westernblot分析各組HSCp-Akt(Thr308)蛋白表達(dá)，Ad-siRNA/PTEN組(2.27±0.

15、02)高于Control組(1.69±0.01)及Ad-EGFP組(1.74±0.01)，P＜0.01;Control組與Ad-EGFP組之間p-Akt(Thr308)表達(dá)無顯著差別（P＞0.05）。⑨腺病毒感染HSC后72h，Western blot分析各組HSC ERK蛋白表達(dá)，Ad-siRNA/PTEN組(0.37±0.03)低于Control組(0.48±0.04)及Ad-EGFP組(0.54±0.04)，P＜0.01;Cont

16、rol組與Ad-EGFP組之間無顯著差別（P＞0.05）。⑩腺病毒感染HSC后72h，Western blot分析各組HSCp-ERK蛋白表達(dá)顯示Ad-siRNA/PTEN組(4.47±0.08)高于Control組(3.29±0.08)及Ad-EGFP組(3.36±0.04)，P＜0.01;Control組與Ad-EGFP組之間p-ERK表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：重組腺病毒Ad-siRNA/PTEN及空病毒