1、新生兒持續(xù)肺動脈高壓(persistent pulmonary hypertension of newborn,PPHN)為新生兒期的嚴(yán)重疾病,出生后肺動脈壓力不下降,胎兒循環(huán)過渡至正常“成人”循環(huán)發(fā)生障礙,當(dāng)其壓力等于或超過體循環(huán)壓力時,出現(xiàn)動脈導(dǎo)管及(或)卵圓孔水平的右向左分流。PPHN患兒往往存在嚴(yán)重的低氧血癥,長期低氧致組織氧合不足,出現(xiàn)酸中毒,最終導(dǎo)致心力衰竭,造成死亡。生后成功的胎兒循環(huán)的轉(zhuǎn)變依賴于肺血管阻力的下降和肺血流的

2、快速增加。介導(dǎo)肺血管阻力降低的因素目前尚未被完全認(rèn)識。目前研究調(diào)節(jié)肺血管張力的四條主要信號通路為:一氧化氮(nitric oxide,NO)／環(huán)鳥甘單磷酸(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)通路、前列環(huán)素／環(huán)腺甘單磷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)通路,內(nèi)皮素通路和Rho激酶途徑。
　　 典型的肺發(fā)育分為五期:胚胎期,假腺體期,小管期,囊泡期和最后

3、的肺泡期和微血管成熟期。人類肺發(fā)育在出生時幾乎完成,生后只發(fā)生部分的肺泡化和微血管的成熟。大鼠在出生時只具有囊泡期的肺,相對于人類,它們只能以較不成熟階段的肺在呼吸空氣的環(huán)境中發(fā)育成熟。在此肺發(fā)育關(guān)鍵期,予10-12％低氧刺激新生仔鼠模擬人類宮內(nèi)缺氧導(dǎo)致PPHN,同樣可導(dǎo)致肺泡和肺微血管結(jié)構(gòu)和功能的損害,從而為成功建立PPHN模型提供理論依據(jù)。低氧性肺動脈高壓(PAH)的病理過程包括初期功能性的肺血管收縮,此后固定性的肺血管官腔狹窄,肺

4、血管阻力提高,血栓形成和最終導(dǎo)致右心衰竭和死亡。一旦發(fā)生肺血管結(jié)構(gòu)重建,以藥物干預(yù)來逆轉(zhuǎn)肺血管阻力至正常范圍大多是徒勞的。因此,尋找有效的細(xì)胞信號通路藥物作用靶點,早期逆轉(zhuǎn)上升的肺血管阻力,干預(yù)肺動脈高壓的進一步惡化,顯得尤為重要。
　　 Ghrelin是在1999年由Kqjima等首次發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)生長激素促分泌素受體的內(nèi)源性配體,為一種28個氨基酸組成的具有生物學(xué)活性的多肽。Ghrelin在體內(nèi)有兩種存在形式:非?；膅hre

5、lin和?；膅hrelin,后者具有生物學(xué)活性能通過GHS—R1a受體而發(fā)揮多種生物學(xué)作用。GHS-R1a分布廣泛,在下丘腦弓狀核表達最高,在心肌組織表達較少。越來越多的研究顯示ghrelin對心血管功能有保護作用,包括降低血管阻力,擴張血管,增加微血管血流量,增加左心射血分?jǐn)?shù),心輸出量和保護缺血再灌注心肌損傷。Ghrelin能減輕野百合堿誘導(dǎo)成年大鼠的PAH,但由野百合堿誘導(dǎo)的PAH機理及藥物治療效果不同于慢性低氧誘導(dǎo)的PAH。近

6、年,Schwenke等提出ghrelin能減輕低氧誘導(dǎo)成年大鼠肺動脈高壓,改善肺血管重建及右心室肥厚,但具體機理未闡明。研究顯示,ghrelin模擬胰島素的作用激活P13K-依賴的信號通路,通過直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮(NO)而舒張血管。在體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中,加入ghrelin能誘導(dǎo)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的磷酸化和一氧化氮(NO)的產(chǎn)生。Ghrelin是否直接誘導(dǎo)舒張血管介質(zhì)的釋放,還是通過G

7、HS-R1a受體調(diào)控第二信使,本課題假設(shè)ghrelin能介導(dǎo)某些信號通路來改善PPHN患兒病情嚴(yán)重程度。
　　 基于上述已探索的PPHN的發(fā)病機制及ghrelin舒張血管的作用機理,本課題以建立常壓低氧新生大鼠肺動脈高壓模型,并用ghrelin進行干預(yù),篩選PPHN及ghrelin作用PPHN后的互為相關(guān)的信號通路,探討ghrelin作用于PPHN相關(guān)靶點蛋白的調(diào)節(jié),深入了解細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,闡明信號刺激所造成的生物學(xué)反應(yīng)過程

8、及其機制,希望能為今后PPHN的治療提供新的途徑。
　　 第一部分低氧誘導(dǎo)新生大鼠肺動脈高壓信號通路的篩選。
　　 目的:
　　 1.建立低氧誘導(dǎo)新生大鼠肺動脈高壓模型,觀察缺氧新生鼠肺組織病理學(xué)的變化及肺小動脈的重建情況,監(jiān)測血流動力學(xué)改變。
　　 2.從整體動物水平篩選低氧性肺動脈高壓新生鼠肺組織基因表達改變的關(guān)鍵信號分子,從而進一步了解PPt{N的病理生理意義。
　　 方法:
　　

9、1.模型建立和分組。
　　 缺氧組:將新生SD大鼠置于密封有機玻璃箱中,調(diào)整氧氣和氮氣的比例,使箱內(nèi)氧濃度維持在12％左右。
　　 對照組:吸入FiO2為0.21(即空氣),具體方法及實驗控制因素同缺氧組。
　　 2.評價模型是否成功。
　　 測量缺氧14天后右心室收縮壓的變化,并用α-SMA免疫組化染色觀察肺血管的肌化程度,測量右心室與左心室加室間隔的比值[ratio of right ventricl

10、e to leftventricle plus septum,RV／(LV+S)]評價右心室肥厚情況。
　　 3.PCR基因芯片篩選肺組織信號通路表達情況
　　 結(jié)果:
　　 1.缺氧后,右心室出現(xiàn)了肥厚,RV／(LV+S)的比值較對照組上升(P<0.05),隨著缺氧時間的延長,RV／(LV+s)的比值進一步上升。對照組右心室平均收縮壓在(20.02±1.02)mmHg,缺氧14天后右心室平均收縮壓明顯升高達(3

11、7.29±3.15)mmHg,兩者有統(tǒng)計學(xué)差異。小動脈的血管壁增厚,非肌型血管出現(xiàn)了不同程度的肌化。
　　 2.缺氧14天后與對照組相比有兩條信號通路中重要基因的域值增長倍數(shù)≥3.0:分別是Wnt信號通路(Lef1,4.79；Wnt,3.87)和CREB信號通路(Cyp19a1,4.87；Egr1,7.79；Fos,3.86)。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功建立低氧性新生大鼠肺動脈高壓大鼠模型。
　　 2

12、.低氧性新生大鼠肺動脈高壓改變Wnt和CREB兩條最為主要的信號通路。
　　 第二部分 Ghrelin調(diào)控低氧性肺動脈高壓信號通路的研究
　　 目的:
　　 1.采ghrelin干預(yù)低氧性新生大鼠肺動脈高壓模型,觀察肺血流動力學(xué)改變和肺血管重建情況。
　　 2.分析ghrelin干預(yù)基因芯片改變情況,進一步驗證芯片結(jié)果,試闡述ghrelin調(diào)控低氧性PAH的信號途徑。
　　 方法:
　　

13、1.模型的建立和分組。
　　 缺氧組:在缺氧前生理鹽水皮下注射(0.2ml),一天一次,持續(xù)14天。
　　 Ghrelin治療組:在缺氧前用ghrelin(150μg／kg,0.2 ml)皮下注射,一天一次,持續(xù)14天。
　　 常氧組:常氧呼吸,生理鹽水皮下注射(0.2ml),一天一次,持續(xù)14天。
　　 Ghrelin對照組:常氧呼吸,用ghrelin(150μg／kg,0.2 ml)皮下注射,一天一次

14、,持續(xù)14天。
　　 2.實驗指標(biāo)檢測。
　　 比較缺氧及ghrelin干預(yù)14天后,肺小動脈重塑及右心室肥厚的變化。檢測血清活性ghrelin濃度,用基因芯片方法檢測,驗證篩選出的Wnt信號通路,檢測GHS-R1a蛋白表達變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.Ghrelin對照組右心室平均收縮壓(mRVSP)19.19±2.12 mmHg,ghrelin治療組mRVSP23.52±40.82 mmHg；缺氧后

15、mRVSP明顯升高達37.29±3.15 mmHg,常氧組mRVSP為20.02±41.02 mmHg,ghrelin治療后右心室平均收縮壓呈顯著下降(P<0.05)。同時,ghrelin治療組RV／(LV+S)的比值0.27±0.02較缺氧組0.51±0.09顯著降低(P<0.05)。大鼠缺氧后α-SMAarea／LD值升高,與常氧組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(194.2±8.8,88.9±4.8,P<0.05),ghrelin治療后α—SMA

16、area／LD顯著下降(107.4±6.8；P=0.000)。
　　 2.Ghrelin治療組血清活性ghrelin濃度為43.75±4.94 pg／ml與缺氧組27.38±5.29 pg／ml相比有顯著性差異(P<0.05)。
　　 3.缺氧后經(jīng)ghrelin治療組與缺氧組相比也有兩條信號通路中重要基因的閾值增長倍數(shù)≥3.0:分別是Wnt信號通路(Birc5,5.05；Myc,3.09；Pparg,4.82)和P13K

17、／Akt信號通路(Fn1,3.60)。缺氧組與常氧組相比,Wnt信號通路(Birc5,-8.76；Myc,1.12；Pparg,-1.59),PI3K／Akt信號通路(Fn1,-2.19)。
　　 4.與缺氧組相比,ghrelin治療組的p-GSK3β／GSK3β和β-catenin蛋白表達水平顯著上升(P<0.05),在ghrelin治療組和ghrelin對照組中均發(fā)現(xiàn)GHSR-1a蛋白表達量顯著高于相應(yīng)對照組(P<0.05)

18、。
　　 結(jié)論:
　　 1.Ghrelin連續(xù)干預(yù)14天對缺氧新生大鼠肺動脈高壓、肺血管重塑、右心室肥厚有改善作用。
　　 2.P13-K／Akt／GSK-3β與Wnt信號通路參與ghrelin善新生大鼠肺動脈高壓發(fā)病機制。
　　 3.GHSR-1a作為中介受體參與ghrelin通過PI3-K／Akt／GSK-3β信號通路發(fā)揮生物作用。
　　 第三部分 Ghrelin影響低氧誘導(dǎo)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋

19、亡及其p-GSK3β／β-catenin信號通路的研究。
　　 目的:
　　 1.建立原代肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞,觀察缺氧的不同時間點,內(nèi)皮細(xì)胞的增殖凋亡。
　　 2.觀察GHS-R1a的變化,PI3-K／Akt／GSK-3β蛋白表達變化,以及β-catenin的分布；評價ghrelin干預(yù)后ghrelin和上述指標(biāo)之間的關(guān)系。
　　 方法:
　　 1.原代大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Rat pulmonar

20、y microvascular endothelial cells,RPMECs)的制備和鑒定。
　　 2.RPMECs細(xì)胞MTT試驗和細(xì)胞凋亡檢測。
　　 3.免疫熒光染色方法檢測GHSR-1a和β-catenin蛋白在RPMECs的表達情況；Western blot法檢測p-Akt和p-GSK3β／GSK3β蛋白在RPMECs的表達情況。
　　 4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶報告基因檢測TOPFLASH質(zhì)粒表達改變。

21、
　　 結(jié)果:
　　 1.RPMECs呈鵝卵石鑲嵌狀排列,狀如梭形或多角形,大小均勻。胞核清晰,呈卵圓孔,胞漿豐富。CD31鑒定95％以上。
　　 2.TUNEL結(jié)果顯示:Hypoxia組、Normoxia+ghrelin組和Hypoxia+ghrelin組的RPMECs凋亡率分別為Normoxia組的:2.77±0.28,0.92±0.07,1.63±0.19RPMECs經(jīng)ghrelin處理后,凋亡細(xì)胞數(shù)顯著下

22、降(P<0.05)。
　　 3.Ghrelin刺激p-Akt表達呈時間劑量依賴性。以相同濃度作用0,5,15,30,60,120 min,p-GSK3β／GSK3β蛋白也出現(xiàn)逐漸上升趨勢,30min后上升,持續(xù)120min。用ghrelin受體阻斷劑[D-Lys3]-GHRP-6干預(yù)后發(fā)現(xiàn),可以降低p—Akt的激活。同樣用特異性Akt抑制劑Ly294002也能降低GSK3β磷酸化表達。
　　 4.ghrelin在低氧條件

23、下誘導(dǎo)RPMECs的β-catenin蛋白轉(zhuǎn)錄入核,ghrelin激活β-catenin／TCF的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 結(jié)論:
　　 1.P13-K／Akt／GSK-3β與Wnt信號通路參與ghrelin保護低氧狀態(tài)下RPMEcs凋亡。
　　 2.在RPMECs中GHSR-1a作為中介受體參與ghrelin通過P-GSK3β／GSK3β信號通路發(fā)揮生物學(xué)作用。
　　 3.成功建立基于Wnt／β-catenin