1、為了比較研究蘇云金桿菌(Bt)亞種間及其Bt工程菌的殺蟲晶體蛋白，了解殺蟲晶體蛋白組成與殺蟲活性之間的內(nèi)在關(guān)系以及深入研究外源基因的導(dǎo)入對(duì)殺蟲晶體蛋白表達(dá)譜及其毒力的影響，本研究首次采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較分析了三種野生Bt亞種菌以及兩種Bt工程菌的殺蟲晶體蛋白的差異。即采用雙向電泳(2-DE)最大限度地分離Bt不同亞種及工程菌的殺蟲晶體蛋白，PDQUEST軟件對(duì)2-DE圖譜進(jìn)行背景消減，斑點(diǎn)檢測等分析，質(zhì)譜鑒定膠內(nèi)酶解的蛋白質(zhì)點(diǎn)，并結(jié)合

2、生物信息學(xué)對(duì)部份蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行了分析。 從所得到的2-DE圖譜可知，Bt三個(gè)亞種及工程菌蛋白質(zhì)斑點(diǎn)主要分布在等電點(diǎn)4-7，分子量10-130kDa的區(qū)域。運(yùn)用PDQUEST軟件對(duì)掃描后的2-DE圖譜進(jìn)行斑點(diǎn)檢測，匹配和量化，在各Bt的2-DE圖譜上檢測到了一定數(shù)量的蛋白質(zhì)點(diǎn)。在Bt庫斯塔克亞種4.0718菌株中檢測到159±21個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，在Bt武漢亞種140菌株中則檢測到184±6個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，Bt以色列亞種H14菌株中366

3、±11個(gè)，工程菌XL004中370±4個(gè)，工程菌XL002菌株中240±4個(gè)。在Bt4.0718與Bt武漢亞種140的2-DE圖譜上約有17個(gè)匹配蛋白質(zhì)點(diǎn)。匹配率為10％；而在Bt4.0718與BtXL004中的2-DE圖譜上約有62個(gè)匹配蛋白質(zhì)點(diǎn)，匹配率為38％。初步反映了它們?cè)诙玖σ约皻⑾x譜的相似性和差異性。 Bt庫斯塔克亞種4.0718菌株中鑒定的晶體蛋白有Cry1Ac、Cry2Aa；Bt武漢亞種140菌株中鑒定有CryI

4、G原毒素、CryH2、Cry1Ab16和Cry2Ac。在BtXL004工程菌中則鑒定了Cry1Ac，Cry2Aa；BtXL002工程菌中鑒定了蛋白有Cry1Ac。 可見鑒定的蛋白中在種類數(shù)量上僅有少部份為具有殺蟲毒力的殺蟲晶體蛋白，說明一種菌中殺蟲晶體蛋白種類比較少。在三個(gè)Bt亞種中沒有發(fā)現(xiàn)相同的殺蟲晶體蛋白。但Bt庫斯塔克亞種4.0718菌株中的晶體蛋白Cry1Ac與Bt武漢亞種140中的晶體蛋白Cry1Ab16、以及Bt庫斯

5、塔克亞種4.0718菌株中的晶體蛋白Cry2Aa與Bt武漢亞種140中的晶體蛋白Cry2Ac具有很高的同源性，其同源性都高于85％。反映了它們殺蟲譜的相似。結(jié)合CPHmodles，DsViewerProTrial和Swiss-PdbViewer軟件分析Cry2Ac和Cry2Aa毒性核心片段發(fā)現(xiàn)Cry2Ac與Cry2Aa的毒性核心片段空間結(jié)構(gòu)基本一致，但在DomainⅡloop2(322IGGLPVYHNSTLH332)處存在顯著差異，說

6、明兩者與中腸受體蛋白結(jié)合的親和力不同，也是導(dǎo)致兩個(gè)亞種不同殺蟲毒力的原因之一。Cry1Ac和Cry2Aa在Bt庫斯塔克亞種4.0718菌株和在轉(zhuǎn)入了cry1Ac和虎紋捕鳥蛛毒素-Ⅰ融合基因的工程菌XL004菌株中表達(dá)，但是這兩種蛋白的表達(dá)量在前者明顯高于后者，生測結(jié)果表明前者毒力也明顯高于后者，說明晶體蛋白的表達(dá)量是晶體蛋白毒力的關(guān)鍵。 這5株菌株中都鑒定有熱休克蛋白60和翻譯延伸因子Tu這兩種蛋白，可能在晶體蛋白形成過程中參與

7、幫助蛋白的折疊中具有重要意義。除此之外，各菌株中均鑒定有一些特殊蛋白，如Bt庫斯塔克亞種4.0718中的谷氨酸消旋酶、定位于膜的胞外蛋白等；Bt武漢亞種140中的Cag毒力島蛋白；Bt以色列亞種中的翻譯延伸因子G，熱休克蛋白60，啟動(dòng)因子ppiase，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子，ATP結(jié)合蛋白等；在XL004工程菌中因子Tu，芽孢形成Ⅳ期蛋白A，丙氨酸脫氫酶；BtXL002工程菌中ATP結(jié)合蛋白o(hù)ppD和組氨酸激酶等蛋白。 丙氨酸脫氫酶僅在B