1、落葉松毛蟲(Dendrolimus superans Butler)又稱西伯利亞松毛蟲，隸屬鱗翅目枯葉蛾科，是我國(guó)北方針葉樹重要的食葉害蟲之一，經(jīng)常周期性爆發(fā)成災(zāi)，給林業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的損失。目前有關(guān)落葉松毛蟲的研究主要集中在生活習(xí)性、預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)、化學(xué)防治、生物防治、物理機(jī)械防治以及誘導(dǎo)抗性選育等方面，而關(guān)于落葉松毛蟲酶學(xué)及生化毒理學(xué)的研究尚未見報(bào)道。本文從生物化學(xué)角度系統(tǒng)分析了乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、超氧化物歧化酶、過(guò)

2、氧化氫酶在落葉松毛蟲6齡幼蟲體內(nèi)的分布特征，通過(guò)正交試驗(yàn)建立了落葉松毛蟲幼蟲乙酰膽堿酯酶的最佳反應(yīng)條件;比較了落葉松毛蟲幼蟲5種酶對(duì)幾種常用農(nóng)藥原藥及制劑的敏感性，分析了殺蟲劑處理后其體內(nèi)5種酶活性的變化規(guī)律。通過(guò)離心、硫酸銨沉淀、離子交換層析、親和層析等方法對(duì)乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶進(jìn)行了純化，并對(duì)純化前后羧酸酯酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，其結(jié)果為高效、低殘留、環(huán)境友好型殺蟲劑的篩選及落葉松毛蟲生化毒理學(xué)研究提供理論依據(jù)。
　　1、通

3、過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析了酶濃度、底物濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度及pH值等因素對(duì)落葉松毛蟲乙酰膽堿酯酶活性的影響，最終確定落葉松毛蟲乙酰膽堿酯酶反應(yīng)的最佳條件為酶液質(zhì)量濃度0.2 g/mL、底物濃度0.8 mmol/L、反應(yīng)體系pH7.5、水浴溫度35℃和反應(yīng)時(shí)間5min;
　　2、落葉松毛蟲6齡幼蟲頭部、中腸、脂肪和表皮4個(gè)組織中AChE、CarE、GST、SOD及CAT活性的分布特征為:AChE分布相對(duì)比較均勻，其中脂肪體中的含量略

4、高于其它組織，占軀體的29.01％，而表皮含量略低于其它組織，占21.16％;CarE主要集中在中腸，占軀體的61.31％，頭部分布最少，僅占軀體的6.37％;GST則主要分布在脂肪體中，占軀體的36.15％，頭部分布最少，僅占軀體的6.58％;頭部的SOD含量最多，占軀體的39.79％，表皮最少，占15.30％; CAT頭部含量最少，僅占軀體的3.66％，脂肪體中含量最多，占38.17％;
　　3、測(cè)定了農(nóng)藥原藥和制劑對(duì)落葉松毛

5、蟲6齡幼蟲5種酶離體活性的影響，其結(jié)果顯示:在殺蟲劑制劑中，2種有機(jī)磷（敵敵畏和辛硫磷）對(duì)落葉松毛蟲幼蟲AChE離體活性抑制程度顯著強(qiáng)于其它制劑，其抑制中濃度分別為1.050×10-9、7.144×10-8 mg/mL;辛硫磷、敵敵畏對(duì)落葉松毛蟲幼蟲CarE離體活性抑制作用最強(qiáng);敵敵畏制劑對(duì)落葉松毛蟲幼蟲GST抑制作用最強(qiáng)（IC50=8.737×10-6 mg/mL），其次為高效氯氟氰菊酯制劑(IC50=7.174×10-3 mg/mL

6、);高效氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯殺蟲劑制劑對(duì)落葉松毛蟲SOD活性抑制性最強(qiáng)，其IC50分別為1.879×10-1和6.115×10-1mg/mL，敵敵畏和辛硫磷對(duì)SOD離體活力抑制程度最弱，在質(zhì)量濃度低于0.05 mg/mL時(shí)表現(xiàn)為誘導(dǎo)激活作用;滅幼脲和阿維菌素對(duì)CAT活性抑制最強(qiáng)，IC50分別為2.233 mg/mL和7.672mg/mL。在供試農(nóng)藥原藥中，2種有機(jī)磷原藥（敵敵畏、氧化樂(lè)果）對(duì)落葉松毛蟲幼蟲AChE離體活性抑制程度顯著

7、強(qiáng)于其它原藥及制劑，其抑制中濃度分別為4.762×10-3 mg/mL和2.369×10-3 mg/mL;敵敵畏、氧化樂(lè)果對(duì)落葉松毛蟲幼蟲CarE離體活性抑制作用最強(qiáng);2種擬除蟲菊酯類原藥（百樹菊酯和高效氯氟氰菊酯）對(duì)落葉松毛蟲幼蟲GST離體抑制作用最強(qiáng);高效氯氟氰菊酯對(duì)離體SOD活性的抑制作用最強(qiáng)，而吡蟲啉最弱;阿維菌素和高效氯氟氰菊酯對(duì)離體CAT活性的抑制作用最強(qiáng)，氧化樂(lè)果抑制力最弱。
　　4、利用點(diǎn)滴法低劑量農(nóng)藥原藥和制劑處

8、理落葉松毛蟲6齡幼蟲敏感品系，研究了供試?yán)ハx體內(nèi)AChE、CarE、GST、SOD和CAT5種酶活性的變化與處理時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果表明，原藥與制劑處理落葉松毛蟲6齡幼蟲后體內(nèi)5種酶活性均發(fā)生了相應(yīng)變化，且存在顯著的時(shí)間效應(yīng)，但處理時(shí)間與酶的比活力并非呈線性關(guān)系。在同一時(shí)間點(diǎn)，殺蟲劑的種類、作用機(jī)理、殺蟲劑作用時(shí)間與5種酶的比活力密切相關(guān)。
　　5、采用硫酸銨沉淀、凝膠層析和親和層析等方法分離純化了落葉松毛蟲6齡幼蟲體內(nèi)的AChE和C

9、arE，并比較分析了粗酶液和純化CarE的生化特性。結(jié)果表明，60％硫酸銨沉淀、Sephadex G-25凝膠層析、Procainamide與CEA親和層析能夠?qū)⒙淙~松毛蟲幼蟲AChE從雜蛋白中較好的純化，但60％硫酸銨沉淀和Sephadex G-25凝膠層析純化效率較低，純化倍數(shù)分別為1.645和11.297倍。CEA親和層析純化效果好于Procainamide親和層析，其純化后的比活力達(dá)162.866μmol/min·mg prot

10、ein，純化的倍數(shù)為115.344倍，回收率為16.510％。
　　利用硫酸銨梯度沉淀、凝膠層析、DEAE纖維素離子交換層析和羥基磷灰石親和層析等技術(shù)純化了落葉松毛蟲6齡幼蟲CarE，得到純化倍數(shù)為138.348倍，回收率為2.782％的目的蛋白CarE，通過(guò)SDS-PAGE估算其分子量約為84.78 kD。以α-NA和β-NA為底物，經(jīng)動(dòng)力學(xué)分析落葉松毛蟲幼蟲粗酶液CarE的Km值分別為8.601×10-5和3.775×10-4

11、 mol/L，是純化酶液的1.989和2.337倍，而CarE純化酶液的Kcat分別為5.824×101和2.306×102min-1，是粗酶液的106.084和135.012倍;落葉松毛蟲6齡幼蟲粗酶液和純化酶液離體CarE對(duì)敵敵畏、阿維菌素、高效氯氟氰菊酯均較敏感。敵敵畏對(duì)CarE活性抑制作用最強(qiáng)，其對(duì)純化酶液CarE的IC50為1.105×10-4 mg/mL，是粗酶液33.394倍，而阿維菌素和高效氯氰菊酯對(duì)粗酶液CarE的IC