1、[目的]
　　 分析結(jié)直腸癌組織和癌旁組織p16基因外顯子1、2的甲基化水平，檢測P16蛋白在結(jié)直腸癌及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，探討p16基因甲基化、P16蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌之間的相關(guān)性，以及p16基因甲基化與P16蛋白表達(dá)的關(guān)系，為進(jìn)一步探討結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)理提供新的思路。
　　 [方法]
　　 1.收集30例手術(shù)切除且病理確診結(jié)直腸癌在術(shù)中留取的癌組織及癌旁組織標(biāo)本，冷凍保存。采用酚仿法提取DNA，用紫外分

2、光光度計(jì)進(jìn)行DNA濃度以及純度的檢測。
　　 2.在NCBI網(wǎng)站上找到p16基因序列，利用MethPrimer軟件對p16基因進(jìn)行CpG島分析，根據(jù)分析結(jié)果用Primer5.0軟件對p16基因外顯子1、2的CpG島分別設(shè)計(jì)引物。
　　 3.提取DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，對p16基因不同片段分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化、甲酸裂解后，用LC-MS/MS進(jìn)行分析。
　　 4.組織經(jīng)固定、包埋及切

3、片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)S-P染色法檢測P16蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 [結(jié)果]
　　 1.對p16基因進(jìn)行CpG島分析，發(fā)現(xiàn)基因exon1和exon2均含有密度較高的CpG島，分別對各區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)及PCR，成功擴(kuò)增出p16 exon1(392bp)和exon2(333bp)。
　　 2.30例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和癌旁組織p16 exon1的平均甲基化水平分別為

4、3.58％和3.28％，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而exon2在腫瘤組織和癌旁組織中的平均甲基化水平分別為29.80％和3.47％，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。不同的Dukes'分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度間p16 exon1和exon2的甲基化水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.30例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中7例有P16蛋白表達(dá)，陽性表達(dá)率為23％(7/30);相對應(yīng)的癌旁正常組織中2

5、2例有P16蛋白表達(dá)，陽性表達(dá)率為73％(22/30)。兩者比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）。而且P16蛋白表達(dá)在不同Dukes'分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度和分化程度間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 [結(jié)論]
　　 結(jié)直腸癌中p16基因外顯子1的甲基化水平無明顯改變，而外顯子2存在明顯的高甲基化。與癌旁正常組織相比，P16蛋白在結(jié)直腸癌中呈低表達(dá)。這些結(jié)果表明，p16基因外顯子2的甲基化可能抑制基因表達(dá)，