1、一、研究目的及背景： 作為藥物評價模型，要求模型動物的藥物代謝反應機制以及藥物與機體與之間的相互作用方面與人具有相似性，利用模型動物能夠較為準確地模擬藥物在人體內的代謝過程。藥物在體內的過程大致可以分為吸收、分布、代謝和排泄四個階段。藥物的藥代動力學性質及其生物利用度、毒副作用及藥物相互作用都由這四個階段決定。其中藥物代謝的主要場所是肝臟。肝臟進行生物轉化則依賴于微粒體中的多種酶系，其中最重要的是細胞色素P450混合功能氧化酶系

2、統(tǒng)。由于該酶系廣泛分布于肝、腎、腦、皮膚、肺、胃腸道及胎盤等組織器官，因此由P450酶系催化的氧化還原反應可發(fā)生在體內許多部位，但仍然以肝臟為主。 P450酶系普遍存在于各種脊椎動物、無脊椎動物、植物、真菌和細菌中。該酶系組成復雜，由基因多樣性控制，稱為P450基因超家族。到目前為止，根據(jù)最新公布的數(shù)據(jù)，僅動物就存在101個P450家族，2345個基因序列。P450基因家族和人類的個體化用藥及藥物的毒副作用密切相關，因此人類的

3、P450已經研究得比較深入，目前發(fā)現(xiàn)57個P450功能基因。而作為成熟模式生物和人類疾病動物模型的小鼠則已發(fā)現(xiàn)102個P450功能基因。豬作為一種具有重要應用前景的藥物評價動物及醫(yī)學生物學實驗動物，其P450基因的研究相對缺乏，目前通過國際細胞色素P450命名委員會命名的僅有30個功能基因。 本研究利用公開數(shù)據(jù)庫的序列資源，用生物信息學方法預測豬的細胞色素P450新基因，以此對我國資源小型豬品系巴馬香豬進行相關基因的克隆，為我國

4、獨特小型豬品系作為藥物評價動物模型提供基礎依據(jù)：同時研究巴馬香豬和貴州小型香豬細胞色素P450關鍵亞型CYP3A29的品系間及品系內多態(tài)性，評估其序列多態(tài)差異對藥物代謝動物模型的影響；對兩種小型豬品系進行微衛(wèi)星遺傳背景檢測分析，觀察動物品系間與品系內微衛(wèi)星遺傳背景差異與其CYP3A29基因多態(tài)的相互關系。 二、研究內容和結果： 1.豬細胞色素P450基因的生物信息學預測和分析 根據(jù)其它哺乳動物的同源P450基因序

5、列，主要利用豬現(xiàn)有的EST數(shù)據(jù)庫，用生物信息學方法對豬P450家族基因進行電子克隆，獲得豬細胞色素P450家族新基因；并對豬細胞色素P450基因進行EST電子表達譜、可變剪接等分析。結果：應用生物信息學方法預測獲得37個可能的豬細胞色素P450新基因序列，利用EST電子表達分析獲得了豬不同組織的P450基因表達數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了豬P450基因的46個可變剪接體，為小型豬藥物代謝研究提供了P450基因的基礎數(shù)據(jù)和資料。通過生物信息學方法共得到3

6、7個可能的豬細胞色素P450薪基因序列，分布于11個家族，19個亞家族.23個亞型。其中9條具有全長編碼區(qū)序列。序列分析表明預測得到的序列均具有P450結構域或與其它物種相應P450序列高度相似，聚類分析表明其和已知豬的P450基因或人的相應P450基因具有同源性。對已知和預測的共52個豬P450基因進行EST電子表達譜分析，獲得了其不同組織的P450基因表達數(shù)據(jù). 2.巴馬香豬預測細胞色素P450基因的克隆和驗證 根據(jù)

7、對豬細胞色素P450基因序列的預測結果，設計引物通過RT-PCR擴增相應基因序列，進行TA克隆和序列測定，與預測的P450基因序列進行比較。結果：克隆獲得了我國資源小型豬品系巴馬香豬的18個細胞色素P450新基因序列，均已在GenBank登錄，登錄號。EF625344-EF625358，并已提交國際細胞色素P450命名委員會進行命名，不僅為小型豬藥物代謝研究提供了P450基因序列資料，同時表明用生物信息學方法結合實驗驗證是快速高效獲得豬

8、P450新基因的有效途徑。對預測的豬細胞色素P450基因19個序列的RT-PCR克隆驗證均獲得了符合預期片段大小的擴增產物，經序列測定和比對，17個P450基因的克隆序列和生物信息學預測結果基本一致，1個克隆序列可能為豬cyp4f6.基因的一個新等位基因。其中1個克隆序列cyp4f2v4和預測序列相差較大，blastx檢索NCBI未發(fā)現(xiàn)相似P450序列，因此把這條序列不作為豬的P450基因序列。cyp4f3vl的擴增序列和原來差異較大，

9、但和cyp4f6v1序列非常相似，并能和cyp4f6vl*1、cyp4f6vl*2、cyp4f6v1*3其同拼接成一條contig，將這條contig用blastx檢索NCBI，未發(fā)現(xiàn)相同序列，但和CYP4F6亞家族有高度相似，故其應為豬cyp4f6基因的一個新變體。 3.小型豬細胞色素P450基因CYP3A29多態(tài)研究 設計引物通過RT-PCR擴增不同個體巴馬香豬和貴州小型香豬的CYP3A29基因編碼區(qū)全長，進行TA克

10、隆和測序，通過序列比對檢測和發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性位點，并對其多態(tài)位點的分布和影響進行分析。結果：發(fā)現(xiàn)了巴馬香豬和貴州小型香豬CYP3A29基因的6個SNP位點及1個可變剪接體，其SNP分布具有品系及個體間多態(tài)性，在不同品系中可呈不同的SNP類型，其中巴馬香豬具有品系內SNP類型的一致性，貴州小型香豬品系內具有SNP類型差異，說明豬P450基因具有和人相似的遺傳多態(tài)性，在豬作為藥物代謝模型的應用中應關注品系及個體間的差異。共獲得13頭巴馬香豬和5

11、頭貴州小型香豬的CYP3A29基因序列，比對結果表明，其中具有6個可能的SNP位點，1個可變剪接體，1個可能的豬CYP3A29亞家族新基因。6個可能的SNP位點中，5個均為同義替換，不改變編碼的氨基酸類型，對編碼的蛋白序列無影響，1個由于堿基缺失引起移碼突變和翻譯提前終止。CYP3A29*1A、CYP3A29*1B、CYP3A29*1C三個SNP位點，均表現(xiàn)為品系間的差異，即巴馬香豬和貴州小型香豬各為一個SNP亞型；位點CYP3A29*

12、1E和CYP3A29*2則表現(xiàn)小型豬品系和其它品系間的序列差異：CYP3A29*1D位點1頭貴州小型香豬和其它貴州小型香豬為不同的SNP類型。貴州小型香豬G3a2902發(fā)現(xiàn)一個可變剪接，其在499-587位發(fā)生片段缺失，并產生移碼使編碼蛋白被截斷。在巴馬香豬B3a2914發(fā)現(xiàn)一個非特異序列，其可能是豬CYP3A亞家族的一個新成員。 4.實驗小型豬群體的微衛(wèi)星遺傳學檢測 選用美國豬基因組協(xié)作計劃推薦用于全球豬遺傳多樣性研究

13、的21個微衛(wèi)星標記，采用微衛(wèi)星熒光標記.半自動基因分型方法，對實驗所用的2個小型豬群體.巴馬香豬和貴州小型香豬進行遺傳學檢測和評估，鑒定其遺傳背景和遺傳關系，分析其個體間相似性和差異程度。結果：巴馬香豬和貴州小型香豬具有較好遺傳穩(wěn)定性，群體內具有良好遺傳多樣性，巴馬香豬的個體均一性要好于貴州小型香豬，兩群體間有較大遺傳差異，其遺傳穩(wěn)定性說明兩種小型豬是適宜醫(yī)學生物學研究的封閉群實驗動物，與人群的遺傳狀況相似；同時其品系間及品系內的遺傳差

14、異與其P450基因的SNP多態(tài)分布相符，進一步說明在豬作為藥物代謝模型的應用中應關注品系及個體間的差異。兩種小型豬及對照榮昌豬和大白豬在所檢21個微衛(wèi)星位點均具有良好遺傳多樣性，共檢測到等位基因281個，每位點7-22個，巴馬香豬、貴州小型香豬、榮昌豬、大白豬分別為132、125、174和119個，巴馬香豬檢測到的等位基因數(shù)要大于貴州小型香豬，但巴馬香豬的遺傳多樣性指數(shù)Shannon信息指數(shù)和多態(tài)信息含量均低于貴州小型香豬，其遺傳雜合度

15、低于貴州小型香豬，純合度高于后者，提示巴馬香豬個體間的相似程度要大于貴州小型香豬。兩種小型豬間的遺傳分化指數(shù)Fst為0.2270，Nei標準遺傳距離為0.9134，提示其群體間遺傳分化較大，具有較大遺傳差異。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測表明，兩種小型豬的21個位點中均有7個偏離平衡，榮昌豬和大白豬則分別有10和11個偏離平衡，表明兩種小型豬在繁育過程中能夠較好地保持遺傳穩(wěn)定性。 三、研究結論： 1.應用生物信

16、息學方法預測獲得37個可能的豬細胞色素P450新基因序列，分布于11個家族，19個亞家族，23個亞型；利用EST電子表達分析獲得了豬不同組織的P450基因表達數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了豬P450基因的46個可變剪接體。為小型豬藥物代謝研究提供了P450基因的基礎數(shù)據(jù)和資料。 2.克隆獲得了我國資源小型豬品系巴馬香豬的18個細胞色素P450新基因序列，均已在GenBank登錄，登錄號EF625344-EF625358，并已提交國際細胞色素P45

17、0命名委員會進行命名，不僅為小型豬藥物代謝研究提供了P450基因序列資料，同時表明用生物信息學方法結合實驗驗證是快速高效獲得豬P450新基因的有效途徑。 3.發(fā)現(xiàn)了巴馬香豬和貴州小型香豬CYP3A29基因的6個SNP位點及1個可變剪接體，其SNP分布具有品系及個體間多態(tài)性，在不同品系中可里不同的SNP類型，其中巴馬香豬具有品系內SNP類型的一致性，貴州小型香豬品系內具有SNP類型差異，說明豬P450基因具有和人相似的遺傳多態(tài)性，