1、目的：研究α-1，6巖藻糖基轉移酶（α-1，6 fucosyltransferase，F(xiàn)UT8）在TGF-β1誘導的人近端腎小管上皮細胞（Human kidney-2，HK-2）-肌成纖維細胞轉分化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）中的作用。 方法：將體外培養(yǎng)的HK-2細胞隨機分為三組：①（CON組）對照組常規(guī)培養(yǎng)；②（TGF組）：加入濃分別為（5、10、20、40）ng/ml的

2、TGF-β1刺激細胞；③（TGFF組）：使用siRNA干擾技術沉默細胞的FUT8基因，隨后再加入20ng/mlTGF-β刺激細胞。前期工作中，我們合成了熒光素標記的FUT8-siRNA并瞬時轉染HK-2細胞，使用倒置熒光顯微鏡檢測siRNA的轉染效率；PT-PCR及FUT8免疫熒光技術分別檢測FUT8-siRNA基因沉默效果及蛋白抑制率。刺激細胞72小時后，觀察各組細胞形態(tài)學改變；分別使用westernblot及免疫熒光技術檢測細胞總F

3、UT8蛋白及其底物α-1，6巖藻糖鏈的表達情況；此外使用免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）結合凝集素印跡檢測特異性結合在TGF-βⅠ/Ⅱ型受體ALK-5（type Ⅰreceptoractivin-likekinase5）及TGF-βRⅡ（TGF-βtypeⅡreceptor）上的巖藻糖鏈的表達；使用免疫熒光技術共染FUT8、ALK5進一步驗證兩者的定位及表達；隨后，使用westernblot及免疫組化染色技術對P

4、-smad2/3進行評估；而α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smoothmuscleactin，α-SMA）也使用免疫組化染色進行評估。 結果：RT-PCR及westernblot檢測結果顯示FUT8-siRNA在100nM濃度下成功干擾HK-2細胞中FUT8基因及蛋白水平的表達，且轉染效率達90%。使用相差顯微鏡觀察CON組細胞呈正常地上皮細胞鋪路石樣形態(tài)；TGF組細胞發(fā)生明顯的形態(tài)學改變，可見細胞肥大、拉長，提示發(fā)生成纖維化

5、改變；而TGFF組可以一定程度的抑制TGF-β1誘導的HK-2細胞形態(tài)的改變。與CON組相比，TGF組FUT8總蛋白表達升高（P<0.05），而其底物巖藻糖鏈并無顯著的變化（P>0.05）；TGFF組與TGF組相比，F(xiàn)UT8蛋白（P<0.01）及其底物巖藻糖鏈（P<0.05）表達都降低。IP結合凝集素印跡顯示特異性結合在TGF-βRⅡ的巖藻糖鏈的表達情況，TGF組與CON組相比表達上調（P<0.05），而TGFF組與TGF組相比明顯下調

6、（P<0.01）；以上變化趨勢與ALK5結合的巖藻糖鏈的變化相同；并且使用熒光共聚焦顯微鏡進一步證實了ALK5與FUT8兩者共表達，并且表達位點完全重合。TGF組呈劑量依賴性上調P-smad2/3表達（P<0.05）；而TGFF組與TGF組比較，F(xiàn)UT8-siRNA可以阻斷其上調（P<0.05）；同樣，α-SMA免疫組化結果顯示TGF-β1可劑量依賴性上調其表達（P<0.05），而可以被FUT8-siRNA所阻斷（P<0.05）。