1、背景：冠心病是人類(lèi)發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一，動(dòng)脈粥樣硬化是其病理基礎(chǔ)。高血壓、糖尿病、吸煙等已公認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因子。其中，在血脂異常致動(dòng)脈粥樣硬化方面，大量的流行病學(xué)和臨床試驗(yàn)對(duì)低密度脂蛋白膽固醇及高密度脂蛋白等進(jìn)行了廣泛而深入的研究。
　　 殘粒脂蛋白(Remnant-like lipoproteins，RLPs)是極低密度脂蛋白和乳糜微粒的脂解產(chǎn)物，其顆粒更小，所含甘油三酯更少，而更加富含膽固醇脂和Apo-E，

2、因此理論上更具有致動(dòng)脈粥樣硬化的特性。人的一天中大部分時(shí)間處于餐后狀態(tài)(>12h)，而餐后狀態(tài)與禁食狀態(tài)相比，血漿中的RLPs濃度明顯升高。有研究認(rèn)為血漿RLPs-C水平是冠心病的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，而不依賴于非脂質(zhì)危險(xiǎn)因子及高密度和低密度脂蛋白膽固醇的水平。進(jìn)一步研究證實(shí)血漿RLPs-C水平與內(nèi)皮功能失調(diào)密切相關(guān)。RLPs-C的幾個(gè)致動(dòng)脈粥樣硬化特性已經(jīng)被證實(shí)(如促進(jìn)炎癥，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成及增加氧化應(yīng)激等)，但RLPs-C與內(nèi)皮功能失調(diào)的相

3、關(guān)機(jī)制仍未完全明確。
　　 已知內(nèi)皮細(xì)胞受損或失功能，是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素。內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)可以分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，是內(nèi)皮細(xì)胞再生和維持內(nèi)皮細(xì)胞層完整性的重要機(jī)制。各類(lèi)致動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因子如ox-LDL可加速內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老，是冠心病的預(yù)測(cè)因子之一。
　　 迄今為止，殘粒脂蛋白與內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老機(jī)制的相關(guān)研究甚少。有待于進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。氧化假

4、說(shuō)是動(dòng)脈粥樣硬化的主要機(jī)制之一。同氧化型低密度脂蛋白一樣，RLPs是否通過(guò)氧化機(jī)制而加速EPCs衰老?有待于進(jìn)一步證實(shí)。
　　 由于DNA雙鏈的半保留復(fù)制，染色體的末端的端粒進(jìn)行性縮短，關(guān)鍵的端粒長(zhǎng)度或“脫帽”導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，從而加速細(xì)胞衰老，被稱為端粒介導(dǎo)的細(xì)胞衰老途徑。端粒酶，可以把一個(gè)小重復(fù)片段“(TTAGGG)n”添加到端粒上，從而可以避免或延緩細(xì)胞發(fā)生衰老。已證實(shí)他汀，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，HDL和雌激素可以抑制或延緩內(nèi)

5、皮祖細(xì)胞的衰老，其機(jī)制或許是通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，降低細(xì)胞內(nèi)外的氧化應(yīng)激，從而增加端粒酶活性。RLPs是否通過(guò)上述端粒酶機(jī)制調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老?有待于進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)深入研究。
　　 微小RNA(microRNA，miRNA)可以通過(guò)與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)節(jié)靶基因的mRNA翻譯，使相關(guān)基因“沉默”或加速相關(guān)蛋白降解而失功能。某些miRNA參與調(diào)控細(xì)胞增值和衰老，且和細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水

6、平有關(guān)。新近報(bào)道，miR-34a過(guò)表達(dá)可經(jīng)由抑制SIF-1(silent information regulator1)而加速內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老。RLPs是否加速內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老進(jìn)而致某些miRNAs變化?是否可以預(yù)測(cè)RLPs誘導(dǎo)的衰老內(nèi)皮祖細(xì)胞相關(guān)miRNAs的有關(guān)基因?目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
　　 目的：本研究利用RLPs干預(yù)人EPCs，通過(guò)檢測(cè)衰老相關(guān)指標(biāo)β-半乳糖苷酶和p16INK4a證實(shí)RLPs是否加速EPCs衰老；應(yīng)用阿托伐他

7、汀(atorvastatin，Ator)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)預(yù)處理細(xì)胞后，檢測(cè)EPCs的FAK、Akt及其磷酸化，明確RLPs是否通過(guò)上述反應(yīng)氧類(lèi)物質(zhì)通路加速內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老；進(jìn)一步探討上述通路與端粒酶途徑的關(guān)系；并篩選衰老相關(guān)miRNAs及預(yù)測(cè)其編碼基因。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)RLPs加速內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老的具體分子機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究，為動(dòng)脈粥樣硬化的產(chǎn)生和發(fā)展提供理論依據(jù)。
　　 方法

8、：
　　 1.建立高脂餐模型，抽取餐后4小時(shí)外周血并應(yīng)用低速離心、免疫親和層析、透析、超速離心及微孔過(guò)濾方法分離出RLPs。
　　 2.通過(guò)酶學(xué)方法、Brawald蛋白濃度及瓊脂糖電泳方法鑒定分離的RLPs純度。
　　 3.利用密度梯度離心分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，并經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)成功EPCs，細(xì)胞流式鑒定EPCs的純度。
　　 4.應(yīng)用不同濃度RLPs干預(yù)EPCs，western blot方法檢測(cè)p16I

9、NK4a蛋白水平，初步確定最佳干預(yù)濃度(RLPs，100μg protein/mL)。將EPCs分為空白對(duì)照組、RLPs干預(yù)組，阿托伐他汀預(yù)處理+RLPs干預(yù)組及超氧化物歧化酶預(yù)處理+RLPs干預(yù)組，應(yīng)用β-半乳糖苷酶化學(xué)染色檢測(cè)衰老細(xì)胞數(shù)。
　　 5.應(yīng)用免疫化學(xué)方法檢測(cè)四組細(xì)胞中nitrotyrosine生成。
　　 6.以不同濃度RLPs干預(yù)EPCs，TRAP-ELISA法檢測(cè)端粒酶活性；再次確定最佳干預(yù)濃度(RL

10、Ps，100μg protein/mL)，將細(xì)胞分為以上四組，應(yīng)用TRAP-ELISA法檢測(cè)端粒酶活性。
　　 7.western blot和免疫共沉淀(IP)方法檢測(cè)磷酸化hTERT蛋白水平，western blot檢測(cè)總hTERT、FAK、Akt及其磷酸化水平。
　　 8.微陣列(micorarray)分析空白對(duì)照組和RLPs(100μg protein/mL)誘導(dǎo)的衰老EPCs細(xì)胞組miRNAs表達(dá)，應(yīng)用real

11、time RT-PCR驗(yàn)證上述篩選的miRNAs。
　　 9.應(yīng)用全部人類(lèi)基因4×44K oligo microarrays芯片測(cè)定全部mRNA表達(dá)，聯(lián)合生物信息學(xué)軟件，共同匹配預(yù)測(cè)相關(guān)miRNAs的靶基因。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過(guò)超速離心、免疫親和層析、透析等方法，可以成功分離RLPs，并經(jīng)酶學(xué)及瓊脂糖電泳分析其純度較高；通過(guò)密度梯度離心及培養(yǎng)分化，可以分離培養(yǎng)純度較高的EPCs。
　　 2.RL

12、Ps濃度依賴性的增加細(xì)胞內(nèi)p16INK4a蛋白水平。與對(duì)照組比較，RLPs(100μg protein/mL)明顯增加β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(P<0.01)，阿托伐他汀(1μmol/L)和超氧化物歧化酶(50U/mL)預(yù)處理后可顯著減少RLPs組的β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(P<0.01)。
　　 3.與對(duì)照組比較，RLPs(100μg protein/mL)明顯增加細(xì)胞內(nèi)nitrotyrosine生成，阿托伐他汀(1μmol/

13、L)和超氧化物歧化酶(50U/mL)預(yù)處理后可顯著抑制RLPs組EPCs的nitrotyrosine生成。
　　 4.RLPs濃度依賴性的抑制端粒酶活性，RLPs(100μg protein/mL)顯著抑制端粒酶級(jí)聯(lián)亞單位人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)及其磷酸化蛋白表達(dá)，阿托伐他汀(1μmol/L)和超氧化物歧化酶(50U/mL)預(yù)處理可顯著改善RLPs組EPCs的端粒酶活性和hTERT蛋白表達(dá)。
　　 5.與對(duì)照組比較

14、，RLPs(100μg protein/mL)顯著抑制FAK、Akt及其磷酸化蛋白表達(dá)，同樣，阿托伐他汀(1μmol/L)和超氧化物歧化酶(50U/mL)預(yù)處理可顯著改善RLPs的上述抑制作用。
　　 6.與對(duì)照組比較，在RLPs(100μg protein/mL)誘導(dǎo)的衰老EPCs中，微陣列分析顯示16個(gè)miRNAs上調(diào)，其中miR-148b，miR-155和miR-513c顯著上調(diào)；6個(gè)miRNAs下調(diào)，其中miR-574-

15、3p顯著下調(diào)。上述結(jié)果經(jīng)real time RT-PCR量化證實(shí)miR-148b，miR-155顯著上調(diào)和miR-574-3p顯著下調(diào)。
　　 7.經(jīng)由生物信息學(xué)軟件及全部mRNA匹配分析后顯示，miR-148b和miR-155的7個(gè)衰老相關(guān)基因被確定(miR-148b：CCKBR，ACVR1，DNMT1，ITGA5，GAP43；miR-155：BACH1，F(xiàn)BXO11)。
　　 結(jié)論：
　　 1.RLPs可加速