1、農(nóng)桿菌遺傳介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT)是獲得絲狀真菌突變體的有效方法之一，并得到廣泛應(yīng)用。尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是引起河北省蘋(píng)果再植病害的一種重要致病菌，為了解其生長(zhǎng)發(fā)育以及分子致病機(jī)制。本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入突變技術(shù)，對(duì)尖孢鐮刀菌HS2菌株進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化，以期獲得轉(zhuǎn)化效率較高的轉(zhuǎn)化體系，從而建立

2、尖孢鐮刀菌的T-DNA插入突變體庫(kù)，并對(duì)部分突變體的生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢能力、致病力、插入拷貝數(shù)以及插入位點(diǎn)側(cè)翼序列進(jìn)行了分析研究，主要結(jié)果如下:
　　1.用攜帶綠色熒光蛋白、卡那霉素抗性基因以及潮霉素抗性基因標(biāo)記的質(zhì)粒pCamhybgfp的農(nóng)桿菌LBA4404菌株對(duì)尖孢鐮刀菌HS2進(jìn)行農(nóng)桿菌遺傳介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，并對(duì)影響轉(zhuǎn)化效率的共培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，所得到的遺傳轉(zhuǎn)化體系:將9mL濃度為106個(gè)/mL尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液與等體積的OD600

3、≈0.3的農(nóng)桿菌LBA4404混合，取200μL混合液在含有200μmol/mL乙酰丁香酮(AS)的IM固體培養(yǎng)基進(jìn)行19-22℃，48h的共培養(yǎng)。利用這一體系，每106個(gè)分生孢子能產(chǎn)生160-200個(gè)轉(zhuǎn)化子。
　　2.利用以上優(yōu)化的轉(zhuǎn)化體系，建立了包含2440個(gè)突變體的突變體庫(kù)。對(duì)其中300個(gè)突變體進(jìn)行了PCR鑒定，并用熒光顯微鏡對(duì)突變體進(jìn)行綠色熒光觀察，其中283個(gè)突變體含有1000bp左右的目的條帶并伴有綠色熒光，T-DNA

4、整合效率達(dá)到94.33％。在對(duì)283株突變體進(jìn)行遺產(chǎn)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)測(cè)定中，經(jīng)過(guò)在PDA上5代繼代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)突變體仍可以在含潮霉素B的PDA上正常生長(zhǎng)，證明外源基因已經(jīng)插入到HS2基因組中并且能夠穩(wěn)定遺傳。
　　3.對(duì)遺傳穩(wěn)定的突變體進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢能力和致病力分析。與野生菌株HS2相比，在對(duì)223株突變體的致病力測(cè)定中，大部分突變體致病力變?nèi)?，其中突變體HS2-2109基本喪失致病力。從致病力缺失的突變體中，選取8株突變體進(jìn)

5、行Southern雜交分析，結(jié)果顯示其中6株突變體為單拷貝插入，1株為雙拷貝插入。
　　4.利用熱不對(duì)稱嵌套PCR(TAIL-PCR)對(duì)產(chǎn)孢量和致病力下降且為單拷貝插入的突變體分別進(jìn)行了側(cè)翼序列擴(kuò)增，共獲得了3條側(cè)翼序列。經(jīng)過(guò)分析，其中突變菌株HS2-100的右翼序列與尖孢鐮刀菌假定蛋白的mRNA序列同源，HS2-100的左翼序列與層出鐮刀菌D02945的des基因、P450-4基因和P450-1基因?yàn)橥葱蛄校琀S2-1107左

6、翼序列與構(gòu)巢曲酶FGSCA4c的Ⅷ染色體的2848590-2848704nt區(qū)域序列同源，而這3條基因的功能都需要進(jìn)一步研究。
　　5.重測(cè)序結(jié)果表明突變菌株HS2-520T-DNA的插入位點(diǎn)在基因組的45604-45615nt處，該位置的基因未有功能注釋，所編碼的蛋白為假定蛋白FOC4_g10004604。突變菌株HS2-406T-DNA的插入位點(diǎn)在基因組的564331-564434nt處，該位點(diǎn)的上游基因?yàn)閍sp1基因，所編碼

7、的蛋白是二磷酸肌醇多磷酸水解酶aps1，位點(diǎn)為559622-563280nt處;它的下游為未知基因，所編碼的蛋白是假定蛋白FOXB_06474，位點(diǎn)在566624-567793nt處。突變體HS2-2109T-DNA的插入位點(diǎn)在基因組的813838-814852nt處，它的上游基因是KIN4，所編碼的蛋白是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶KIN4，位點(diǎn)在809998-813406nt處;它的下游基因是GWT1，所編碼的蛋白是糖基磷脂酰肌醇-錨定壁