1、人類γδT細胞是T淋巴細胞中的一個特殊群體,在機體抗腫瘤及抗感染免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。然而,由于已發(fā)現(xiàn)和鑒定出的抗原(或配體)數(shù)量有限,且缺乏相應(yīng)的反應(yīng)性亞克隆T細胞抗原識別受體(T cell receptor,TCR)的結(jié)構(gòu)信息,γδT細胞與腫瘤細胞或病毒感染細胞之間相互作用的分子機制尚有待于進一步闡明。
　　 人類MutS同源蛋白2(Human MutS homologue2,hMSH2)是DNA錯配修復(fù)蛋白家族的一個重

2、要成員,通常定位于細胞核并與hMSH3或hMSH6形成異源二聚體,參與修復(fù)DNA合成中的堿基錯配,以保證基因組的忠實性。遺傳性或獲得性的hMSH2缺陷與諸多癌癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。在前期的研究工作中,本實驗室采用基于TCR互補決定區(qū)36鏈(Complementary determining region36chain,CDR3δ)肽結(jié)合特性的免疫親和篩選技術(shù)策略,用OT3肽探針從卵巢癌細胞系SKOV3的細胞提取物中釣取了三個可能

3、被Vδ2 TCR識別的配體,hMSH2是其中之一。初步的研究結(jié)果表明,hMSH2在SKOV3的細胞表面有異位表達,γδT細胞對SKOV3細胞的殺傷作用亦可為抗hMSH2抗體(Antibody,Ab)部分封閉。鑒于此,我們推測hMSH2是一個能為γδT細胞所識別的、腫瘤相關(guān)的內(nèi)源性抗原(或配體)分子。本研究旨在對此進行驗證,并進一步探討γδT細胞識別hMSH2的分子機制及hMSF12在γδT細胞介導(dǎo)的天然免疫監(jiān)視應(yīng)答中的作用和意義。

4、>　　 本文的第一項研究內(nèi)容旨在探索hMSH2的膜異位表達在上皮腫瘤細胞中是否具有普遍意義。針對此問題,分析了宮頸癌、胃癌、肺癌、結(jié)直腸癌及卵巢癌腫瘤細胞系HeLa、803、NCI-H520、HR8348、SKOV3、HO8910及ES-2細胞中hMSH2的基因序列、mRNA水平及蛋白質(zhì)表達情況,并對這五種腫瘤病人癌組織標本中hMSH2的分布進行了分析。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明,hMSH2在受測的七種上皮腫瘤細胞表面均存在異位表達(陽性

5、率14.2～68.2％),而在正常對照細胞HK-2、成纖維細胞及γδT細胞表面則幾乎沒有表達(陽性率<2.2％),提示hMSH2的膜異位表達在上皮腫瘤細胞中可能具有普遍意義。激光共聚焦掃描顯微鏡術(shù)和免疫組織化學(xué)染色分析的結(jié)果也顯示,hMSH2在上皮腫瘤細胞中出現(xiàn)異常的亞細胞分布,表現(xiàn)為廣泛的胞膜、胞質(zhì)異位表達,胞核分布則多減弱或消失。基因測序結(jié)果表明,hMSH2的藎因序列在大多數(shù)上皮腫瘤細胞系中并無突變,其mRNA表達水平在不同上皮腫瘤

6、細胞系問也存在較大差異。
　　 hMSH2在上皮腫瘤細胞表面不尋常的異位表達為其作為γδT細胞識別的配體提供了可能。因此,本文的第二項研究內(nèi)容重點驗證了γδT細胞對腫瘤細胞膜異位表達的hMSH2的識別作用。首先,運用抗體殺傷封閉實驗,在HeLa、803及NCI—H520細胞中初步證實了hMSH2的膜異位表達與γδT細胞對上皮腫瘤細胞的細胞毒作用間存在聯(lián)系。其次,運用小RNA干擾(Small interference RNA,si

7、RNA)技術(shù)靶向沉默HeLa、803及NCI-H520細胞中hMSH2的表達,并比較γδT細胞對干擾組及Mock組殺傷效率的差異。結(jié)果表明,異位表達的hMSH2的確能被γδT細胞識別,并參與γδT細胞對上皮細胞腫瘤的免疫監(jiān)視作用。隨后,通過殺傷實驗及重組hMSH2(Recombinant hMSH2,rhMSH2)體外刺激實驗進一步證實Vδ2 T細胞是hMSH2的主要反應(yīng)性γδT細胞亞群。最后,通過對HeLa、803及NCI-H520細

8、胞膜蛋白的分離純化Western blot分析,鑒定出上皮腫瘤細胞膜異位表達的hMSH2為分子量(Molecular weight,MW)約105千道爾頓(Kilodalton,kDa)的全長蛋白質(zhì)。
　　 由于Vδ2 T細胞組成性地表達NKG2D受體,且有研究表明γδT細胞的某些配體分子如MHCⅠ類分子鏈相關(guān)抗原A和B(MHC classⅠ-related chains A and B,MICA/B)、UL16結(jié)合蛋白4(UL

9、16-binding protein4,ULBP4)等存在TCR及NKG2D雙重識別機制,本文的第三項研究內(nèi)容著重探討了γδT細胞對hMSH2的識別是否同樣存在TCRγδ及NKG2D雙重途徑。首先,用抗體封閉與siRNA干擾相結(jié)合的方法,研究TCRγδ和/或NKG2D封閉是否能夠抑制膜異位表達hMSH2所介導(dǎo)的γδT細胞(或NK-92細胞)對腫瘤細胞的識別與殺傷作用；其次,將rhMSH2蛋白在體外與γδT細胞預(yù)孵育,經(jīng)流式細胞術(shù)分析rh

10、MSH2對TCRγδ及NKG2D的競爭性結(jié)合作用;此外,運用表面離子共振技術(shù)(Surface plasmon resonance,SPR)對NKG2D與rhMSH2的直接結(jié)合作用及親和力進行了進一步分析。結(jié)果顯示,hMSH2介導(dǎo)的γδT細胞(或NK-92細胞)對腫瘤細胞的識別與殺傷能被anti—TCRγδ和/或anti-NKG2D Ab封閉所抑制；rhMSH2能競爭性地與TCRγδ及NKG2D結(jié)合；NKG2D能直接與rhMSH2結(jié)合,K

11、d值為132 nM。這些結(jié)果說明γδT細胞對hMSH2的識別存在TCRγδ及NKG2D雙重途徑。
　　 γδT細胞在抗病毒感染免疫中發(fā)揮著重要作用。γδT細胞識別的某些內(nèi)源性抗原(或配體)分子,如熱休克蛋白(Heat shock protein,HSP)90、HSP60及ULBPs等,在病毒感染細胞中出現(xiàn)表達上調(diào)。因此,本文的第四項研究內(nèi)容通過建立Epstein-barr病毒(Epstein-barr virus,EBV)轉(zhuǎn)化細

12、胞模型,觀察hMSH2在EBV轉(zhuǎn)化類淋巴母細胞中的農(nóng)達變化及這種變化對γδT細胞清除病毒感染細胞作用的影響,進一步研究了hMSH2在γδT細胞介導(dǎo)的病毒感染免疫監(jiān)視中的作用。結(jié)果表明,EBV感染細胞hMSH2的轉(zhuǎn)錄水平及膜異位表達均明顯增高；膜異位表達的hMSH2亦介導(dǎo)了γδT細胞對EBV感染細胞的識別,并顯著增強了γδT細胞的靶向殺傷作用。這提示hMSH2可能如γδT細胞識別的大多數(shù)內(nèi)源性抗原(或配體)一樣具有應(yīng)激分子的特性,且在γδ

13、T細胞介導(dǎo)的抗EBV感染免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。
　　 綜上所述,本文得出的主要結(jié)論如下:(1)hMSH2的膜異位表達在上皮腫瘤細胞中具有一定的普遍性；(2)異位表達的hMSH2能被γδT細胞的抗原識別受體TCRγδ和NKG2D雙重識別,并主要參與Vδ2 T細胞介導(dǎo)的對腫瘤細胞的殺傷作用;(3)上皮腫瘤細胞膜異位表達的hMSH2為MW約105 kDa的全長蛋白;(4)hMSH2的異位表達能被EBV感染所誘導(dǎo),并顯著增強γδT細胞

14、對病毒感染細胞的清除作用。
　　 本研究的創(chuàng)新點體現(xiàn)在:一是初步驗證了hMSH2的膜異位表達在上皮腫瘤細胞中具有一定的普遍性,提示hMSH2可能是一個新發(fā)現(xiàn)的上皮腫瘤標志分子；二是首次證明hMSH2作為一個腫瘤相關(guān)的內(nèi)源性抗原分子,能通過TCRγδ及NKG2D雙重識別途徑被γδT細胞識別,為γδT細胞識別的抗原(或配體)譜增添了新的分子,揭示了γδT細胞識別、殺傷上皮來源腫瘤細胞的新的分子機制；三是首次報道了hMSH2分子在EB

15、V感染細胞中的誘導(dǎo)表達,并闡明了該分子在γδT細胞介導(dǎo)的抗EBV感染免疫中的作用,揭示了γδT細胞識別和清除EBV病毒感染細胞的新的分子機制,豐富了目前對γδT細胞在病毒感染免疫中重要作用的認識。
　　 總之,本文通過對上皮來源腫瘤細胞及EBV轉(zhuǎn)化B細胞表面hMSH2的異位表達及γδT細胞對其識別機制的深入研究,進一步揭示了γδT細胞免疫監(jiān)視的新型作用方式,為全面闡明γδT細胞的生物學(xué)功能提供了新的線索,亦為建立新的腫瘤及病毒感