1、南昌鏈霉菌(Streptomyces nanchangensis NS3226)是從江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園油茶根際土壤中分離篩選到的一株鏈霉菌新種。前期研究發(fā)現(xiàn)該菌株至少產(chǎn)生兩種抗生素,聚醚類抗生素南昌霉素(nanchangmycin)和十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素梅嶺霉素(meilingmycin)。南昌霉素具有抗雞球蟲病和革蘭氏陽性菌活性,近期研究發(fā)現(xiàn)該類化合物有抗瘧原蟲的活性,以及抗HIV病毒的活性。南昌霉素生物合成基因簇已被成功克隆并測序

2、,這些序列帶給我們很多信息來認識聚醚類抗生素的生物合成機理。從多個聚醚類抗生素基因簇序列分析上可以看出,聚醚抗生素的骨架是由模塊化的I型聚酮合酶合成的,但是該基因簇不含有I型聚酮合酶所含有的起到釋放產(chǎn)物作用的I型硫脂酶。分別對南昌霉素基因簇中兩個可能的候選對象CR結(jié)構(gòu)域以及nanE基因進行同框缺失及互補,并且用來自于紅霉素和阿維菌素基因簇的I型硫脂酶對CR結(jié)構(gòu)域在染色體上進行替換。體內(nèi)實驗證明CR結(jié)構(gòu)域以及nanE基因都與南昌霉素合成相

3、關(guān),并且I型硫脂酶在南昌鏈霉菌中不能起到釋放產(chǎn)物的作用。隨后CR結(jié)構(gòu)域,ACP14-CR雙結(jié)構(gòu)域,NanE在大腸桿菌中成功得以異源表達,并純化得到可溶性蛋白。作為對照,MonAX(聚醚類抗生素莫能霉素基因簇中可能負責(zé)產(chǎn)物釋放的因子)和紅霉素I型硫脂酶DEBS TE也在大腸桿菌中成功得以異源表達,并純化得到可溶性蛋白。模擬南昌霉素硫脂酶底物nanchangmycin- SNAC通過化學(xué)合成方法得到,并用底物di-ketide-SNAC作為

4、對照,與CR結(jié)構(gòu)域,ACP14-CR雙結(jié)構(gòu)域,NanE,MonAX和DEBS TE進行酶促反應(yīng)。雖然NanE,MonAX和DEBS TE都對底物di-ketide-SNAC有水解活性,NanE活性最弱,MonAX活性最強,但是結(jié)果只有NanE可以水解聚醚類硫脂酶底物nanchangmycin-SNAC產(chǎn)生nanchangmycin,而CR結(jié)構(gòu)域,ACP14-CR雙結(jié)構(gòu)域沒有表現(xiàn)出任何硫脂酶活性。所以,體外結(jié)果清晰證明在南昌霉素生物合成途

5、徑中NanE負責(zé)聚醚產(chǎn)物的最終釋放。通過對NanE蛋白序列與其他硫脂酶比對分析以及對其三維結(jié)構(gòu)的Modeling,推測氨基酸Ser96,Asp120,His261是聚醚硫脂酶NanE的活性中心。將Ser96突變?yōu)锳la,Asp120突變?yōu)锳sn,His261突變?yōu)镚ln,這三個突變蛋白都失去了對nanchangmycin-SNAC的水解活性,說明Ser96,Asp120,His261是聚醚硫脂酶NanE的活性中心。與其他硫脂酶相比較,聚

6、醚類硫脂酶活性位點絲氨酸相鄰的總是Trp,而其他硫脂酶是Ala,所以將Trp97突變?yōu)锳la。這個突變蛋白雖然喪失了對nanchangmycin-SNAC的水解活性,但是仍然保留著對di-ketide-SNAC的水解活性。通過動力學(xué)研究,與野生型相比,突變蛋白NanE W97A表現(xiàn)出不同的di-ketide-SNAC底物偏向性。這說明對于NanE來說W97也是一個非常重要的氨基酸,它幫助NanE選擇底物,以及調(diào)節(jié)反應(yīng)速度。通過對糖基轉(zhuǎn)移

7、酶nanG5的基因敲除,分離到脫糖基南昌霉素,并通過核磁共振和質(zhì)譜對其結(jié)構(gòu)進行確認,但其產(chǎn)量只為野生型南昌霉素的百分之一。為了研究NanE對底物的特異選擇性,聚醚類底物salinomycin(鹽霉素)-SNAC,monensin(莫能霉素)-SANC,nanchangmycin(南昌霉素)-SNAC以及nanchangmycin aglycone(脫糖基南昌霉素)-SNAC被通過化學(xué)方法合成,并與NanE進行體外反應(yīng),結(jié)果除salino

8、mycin-SNAC外,其他聚醚類SNAC底物都能被NanE水解為相應(yīng)的聚醚。但是NanE既不能水解也不能環(huán)化聚酮類底物,seco-10-deoxymethynolide-SNAC和seco-7-dihydro-10-deoxy- methylnolide-SNAC。通過對酶的動力學(xué)研究,nanchangmycin-SNAC是NanE蛋白的最適底物,其kcat/Km值為最大,而其Km最小,僅為24±2μM,比底物nanchangmyci

9、n aglycone-SNAC小9倍,比di-ketide-SNAC小接近1000倍。這個體外結(jié)果也間接說明4-O-methyl-L-rhodinose是先由糖基轉(zhuǎn)移酶NanG5加載到聚醚骨架上,然后才被NanE識別所釋放的。本論文中還對NanE的蛋白結(jié)晶進行了探索,由于在其他硫脂酶的結(jié)晶中His-tag的去除常常有利于蛋白的結(jié)晶,但是發(fā)現(xiàn)常用來去除His-tag凝血酶,會將NanE切成兩段,后來發(fā)現(xiàn)蛋白酶HRV3C可以非常高效并且特異

10、的切除NanE的His-tag。初步實驗顯示NanE蛋白與ACP13和ACP14-CR結(jié)構(gòu)域之間沒有很強的蛋白與蛋白的相互作用。為了研究南昌霉素由聚酮轉(zhuǎn)化聚醚的機制,對NanO以及NanI的功能進行了初步探索,并且發(fā)現(xiàn)以NanO保守序列設(shè)計簡拼引物來尋找新的聚醚類抗生素于傳統(tǒng)的用PKS探針異源雜交相比是一條快速方便的途徑。而且為了研究南昌霉素前體聚酮鏈上的雙鍵構(gòu)型是E,E構(gòu)型還是Z,Z構(gòu)型,NANS Module3+ TE,Module

11、7+ TE基因被克隆到pET28a表達載體上,并表達為可溶性蛋白,通過與相應(yīng)的SNAC底物反應(yīng),這兩個巨型蛋白(超過200KDa)都變現(xiàn)出一定活性,其產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)正在鑒定之中。為了進一步深入認識南昌霉素的合成機理,NANS Module2+ TE基因被克隆到pET28a表達載體上,并表達為可溶性蛋白(超過250KDa),module2為一個完整模塊,它含有聚酮合酶的所有結(jié)構(gòu)域,KS,AT,DH,ER,KR,ACP,該巨型蛋白是研究DH,E

12、R,KR結(jié)構(gòu)域以及完整module活性的非常理想的材料。原有梅嶺霉素生物合成基因簇的左側(cè)包括PKS基因的一大段區(qū)域(柯斯質(zhì)粒14A1編碼)被通過基因敲除的方法證明該區(qū)域沒有參與梅嶺霉素的合成。通過建立7-9 kb SacI片段的亞克隆文庫,向基因簇右側(cè)步移,得到4個陽性克隆,其中亞克隆4H1被測序,對該測序區(qū)域的生物信息學(xué)分析揭示了該區(qū)域基因可能編碼梅嶺霉素的側(cè)鏈的合成。進一步以4H1右側(cè)序列設(shè)計探針,繼續(xù)向右側(cè)進行染色體步移,得到陽性

13、柯斯質(zhì)粒9B8,對9B8的測序補全了梅嶺霉素側(cè)鏈的合成的基因簇,但是梅嶺霉素生物合成基因簇仍然缺少包括loading module,module1和module2等PKS基因。以milbemycin生物合成基因簇module2中的ER結(jié)構(gòu)域的核酸序列設(shè)計引物PCR,在南昌鏈霉菌中調(diào)到一段序列,與已知序列高度同源。同樣通過PCR的方法在基因文庫中找到陽性柯斯質(zhì)粒8B3,對其編碼區(qū)域在染色體上進行大片段缺失,得到突變株的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)HPLC-