1、一．原代視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的混合培養(yǎng) 目的：建立原代視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞混合培養(yǎng)的方法。 方法：取生后2-3天的SD大鼠視網(wǎng)膜組織，0.08％胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液（1～1.2×106個(gè)/ml），接種于涂以鼠尾膠原的培養(yǎng)板, 用含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。取培養(yǎng)4天的細(xì)胞行神經(jīng)元特異性烯醇酶（neurone specific enolase, NSE）和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidi

2、c protein,GFAP）免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，鑒定神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞，并分別計(jì)算各自陽性細(xì)胞的百分比。取培養(yǎng)48h,72h,96h的細(xì)胞行蘇丹黑B染色，圖像分析法測量細(xì)胞胞體直徑和軸突長度；取培養(yǎng)96h的細(xì)胞用流式FITC-Annexin V/PI雙標(biāo)法檢測培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況。 結(jié)果：在鼠尾膠原上培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞生長良好,部分細(xì)胞伸出突起。培養(yǎng)體系中， NSE染色陽性細(xì)胞數(shù)占(93.015±2

3、.649)％， GFAP染色陽性細(xì)胞數(shù)占(1.920±0.074)％；培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞胞體直徑和軸突長度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸增大增長；有血清培養(yǎng)的細(xì)胞早期凋亡率為(4.98±0.55)％，總凋亡率為（11.05±2.10）％，無血清培養(yǎng)細(xì)胞早期凋亡率為(14.63±1.24)％，總凋亡率為（21.62±3.14）％，兩者比較差異均有顯著性意義（P=0.002,0.049）； 結(jié)論：混合培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中神經(jīng)細(xì)胞純度高，生

4、長狀態(tài)好，適合作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究的細(xì)胞模型。 二．促紅細(xì)胞生成素促混合培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞軸突生長的作用 目的：觀察促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin,EPO）對(duì)培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞胞體直徑和軸突長度的影響。 方法：用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測培養(yǎng)視網(wǎng)膜細(xì)胞EPO和EPO受體（erythropoietin receptor,EPOR）的表達(dá)；在培養(yǎng)液中分別添加1.0U/ml、3.0 U/ml和6.0 U/ml

5、的EPO培養(yǎng)細(xì)胞96小時(shí)后，予蘇丹黑B染色,圖像分析法測量各組培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞胞體直徑和軸突長度。 結(jié)果：1.混合培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞均有EPO和EPOR表達(dá)；2. EPO對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的胞體直徑無明顯影響（P>0.05）；3.培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的軸突長度隨著EPO濃度的升高而增長，呈劑量依賴性，EPO濃度為6.0 U/ml時(shí)，可達(dá)對(duì)照組的162.8％。 結(jié)論：一定濃度的EPO在體外短期內(nèi)能夠促進(jìn)培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的

6、軸突生長。 三．促紅細(xì)胞生成素促進(jìn)谷氨酸毒性作用下混合培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的存活 目的：觀察EPO對(duì)谷氨酸毒性作用下培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞存活和凋亡的影響。 方法：分別將0.3 U/ml、1.8 U/ml和3.0 U/ml的EPO作用于無血清培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞18和36小時(shí)；或作用于無血清培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞12小時(shí)后，再分別加入5mmol/L和10mmol/L谷氨酸溶液繼續(xù)培養(yǎng)36小時(shí)后，用MTT法檢測細(xì)胞

7、的存活和流式FITC-Annexin V/PI雙標(biāo)法檢測細(xì)胞凋亡。 結(jié)果：1.各濃度的EPO(0.3 U/ml、1.8 U/ml和3.0 U/ml)對(duì)無血清培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的存活(18小時(shí)P=0.815,0.998,0.521；36小時(shí)P=0.392,0.807,0.765)和凋亡(早期凋亡率P=0.814，0.772，0.913；晚期凋亡率P=0.391，0.567，0.598；總凋亡率P=0.582，0.567，0.72

8、4)均無影響。2. 谷氨酸濃度為5mmol/L時(shí), 0.3 U/ml，1.8U/ml，3.0 U/mlEPO均能明顯提高培養(yǎng)細(xì)胞的存活（P=0.039,0.023,0.001），減少培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的早期凋亡率（P=0.006,0.000,0.000）；1.8U/ml和3.0U/mlEPO能減少培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的總凋亡率(P=0.016,0.000)。谷氨酸濃度為10mmol/L時(shí)，3.0 U/mlEPO能明顯提高培養(yǎng)細(xì)胞的存活(P=0.000