1、沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文柞蠶品種資源遺傳多樣性的RAPD及ISSR標(biāo)記分析姓名：李敏申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物飼養(yǎng)指導(dǎo)教師：秦利20070611沈日I農(nóng)業(yè)人學(xué)碩十學(xué)位論文摘要柞蠶(Antheraeapernyi)是中國(guó)特有的生物資源，也是重要的資源昆蟲之一。柞蠶種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究對(duì)于有效利用現(xiàn)有柞蠶資源，選育高產(chǎn)、抗病新品種等具有重要理論意義及應(yīng)用價(jià)值。目前柞蠶品種分類主要是依據(jù)幼蟲5齡期的體色或化性進(jìn)行的，但這種僅僅依

2、靠體色或化性進(jìn)行的分類方法是不完備的，難以有效反映不同柞蠶品種之間的遺傳多樣性。分子標(biāo)記技術(shù)是從分子水平上檢測(cè)DNA的遺傳多樣性，因其不受環(huán)境及發(fā)育時(shí)期等因素影響，因此成為昆蟲等生物的系統(tǒng)進(jìn)化、品種間的親緣關(guān)系分析等的主要研究手段之一。本文采用RAPD標(biāo)記和ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)收集到的66份品種資源進(jìn)行了遺傳多樣性研究，以期從分子水平揭示它們之間的親緣關(guān)系，為柞蠶遺傳資源的鑒定及品種資源的發(fā)掘、利用提供分子水平的依據(jù)。結(jié)果如下：1通過(guò)優(yōu)化

3、、篩選建立了適合柞蠶基因組的ISSR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序。優(yōu)化后的PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94“C變性60s，退火溫度因引物不同而異，時(shí)『自J為90s，72℃延伸2min，36個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。并且還發(fā)現(xiàn)，不同引物的退火溫度應(yīng)在計(jì)算引物Tm值的基礎(chǔ)上，再略微升高1～2“C，會(huì)得到較為理想的擴(kuò)增結(jié)果。2從30個(gè)ISSR引物中篩選出11個(gè)多念性好的引物進(jìn)行PCR分析，11個(gè)ISSR引物擴(kuò)增的DNA條帶數(shù)分別在乒14

4、條之間，共擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定性好的多態(tài)性條帶118條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增帶數(shù)為1072條，分子量從100～2000bp，多態(tài)性條帶比率(PercentageofPolymorphismBands，PPB)為9067％。其中擴(kuò)增條帶數(shù)最多的是引物ISSR02，共擴(kuò)增出14條帶，其中11條有多態(tài)性。擴(kuò)增條帶數(shù)最少的為引物ISSR05，只擴(kuò)增出6條帶，僅有2條有多態(tài)性。在供試的66個(gè)柞蠶品種中，有2個(gè)品種擴(kuò)增出品種特有帶，分別是741和特大l號(hào)。

5、從30個(gè)RAPD引物中篩選出11個(gè)多態(tài)性好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析，11個(gè)RAPD引物擴(kuò)增的DNA條帶數(shù)分別在10～14條之間，共擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定性好的多態(tài)性條帶124條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增帶數(shù)為1127條，分子量從100～2000bp，PPB為8709％。其中擴(kuò)增條帶數(shù)最多的是引物RAPD01，共擴(kuò)增出14條帶，其中12條有多態(tài)性。3比較利用ISSR標(biāo)記與RAPD標(biāo)記得到的66份供試材料之間的遺傳相似性系數(shù)，發(fā)現(xiàn)兩種標(biāo)記檢測(cè)出的遺傳相似