1、背景及目的：逼尿肌過度活動(DO)是一種常見的膀胱功能障礙，可以引起尿急、尿頻甚至急迫性尿失禁等臨床表現(xiàn)，嚴重影響了患者的正常生活和身心健康，同時也日益成為社會公共醫(yī)療系統(tǒng)的沉重負擔。正常膀胱在儲尿期處于一種“安靜”的狀態(tài)，并且由于良好的順應性，在一定容量范圍內(nèi)都保持很低的腔內(nèi)壓，這有利于尿液從上尿路的輸送以及避免尿液的膀胱一輸尿管反流。這個過程是下尿路器官在一系列復雜的神經(jīng)、體液、心理意識以及自身等因素的調(diào)控下完成的協(xié)調(diào)過程。一旦由于

2、某種原因，此種和諧遭到破壞，膀胱出現(xiàn)了不受意識控制的收縮，就會出現(xiàn)上述的臨床表現(xiàn)，這些癥候群被統(tǒng)稱為膀胱過度活動癥(overactive bladder，OAB)，而這種自發(fā)性膀胱收縮則被稱為逼尿肌過度活動(DO)并可以被臨床尿動力學檢查所記錄和診斷。DO在西方國家發(fā)病率很高，被列為10種最常見的慢性疾病之一；國內(nèi)雖然沒有大規(guī)模的臨床流行病學報告確切的發(fā)病率，然而就泌尿臨床診治情況來看，屬于非常常見的疾病。DO目前尚無理想的治療方法，最

3、常用抗膽堿能藥物進行治療，但由于副作用過大，療效有限，患者的治療依從性非常差。因此，迫切需要尋找新的有效的替代療法。 關(guān)于DO的發(fā)病機制已經(jīng)進行了大量的基礎研究。綜合來看，原因復雜，可能系多因素參與致病，不同病因?qū)е碌腄O可能有不同的發(fā)病機理，但確切的發(fā)病機制還遠未明了。目前，主要學說可歸納成神經(jīng)源性和肌源性兩種。按照ICS的分類，DO可分成特發(fā)性(idiopathic detrusor overactivity)和神經(jīng)源性(n

4、eurogenic detrusoroveractivity)兩種。具有相關(guān)聯(lián)的神經(jīng)系統(tǒng)病變者稱為神經(jīng)源性，其余歸為特發(fā)性，而后者最常繼發(fā)于BOO性疾病，其中以BPH最為多見。盡管DO可能是多因素疾病，但目前已有大量證據(jù)表明，繼發(fā)于梗阻后的膀胱逼尿肌本身結(jié)構(gòu)和功能的改變在BOO所致DO的發(fā)生中占有極為重要的地位，即“肌源性”機理。針對不同病因所致DO可能具有不同發(fā)病機理這一特點，并且考慮到BOO所致DO為臨床最為常見的類型，本課題擬針對

5、BOO性DO的發(fā)生機理展開研究。在“肌源性”學說所提出的重要機理方面，認為“逼尿肌興奮性升高與DO有著密切的關(guān)系”。但我們廣泛查閱了相關(guān)文獻后發(fā)現(xiàn)，這一重要的機理尚缺乏直接的證據(jù)支持。為此，以此做為課題的切入點。首先，第一部分應用目前研究細胞興奮性最好的技術(shù)-穿孔膜片鉗全細胞記錄，在具有“真電流鉗”功能的新型膜片鉗放大器EPC-10上，選取評價興奮性的可靠指標，對BOO性DO大鼠逼尿的興奮性與正常逼尿肌進行檢測與比較。然后，進一步研究這

6、種高興奮狀態(tài)的具體分子機理(離子通道機制)，選取在調(diào)控正常逼尿肌興奮性中具有最重要作用的電壓依賴性鈣通道(VDCC)和大電導鈣激活鉀通道(BKca)作為主要研究對象，對逼尿肌興奮的啟動和抑制這兩個層面進行考察。沿著這條主線，在第二部分中主要針對VDCC中的L型和T型的變化進行探索。綜合應用膜片鉗技術(shù)、激光共聚焦逼尿肌鈣熒光探針濃度測量并結(jié)合相應的藥理學工具，對BOO性DO逼尿肌VDCC中的L和T性鈣通道的電學特性及其在細胞靜息鈣濃度調(diào)控

7、進行檢測并與正常逼尿肌進行比較，明確鈣通道活動的改變及其與高興奮性的關(guān)系；在第三部分，應用膜片鉗技術(shù)，從單通道、全細胞電流密度以及瞬時外向鉀電流(STOCs)三個方面對BKca通道的活性改變進行觀察和比較，同時應用免疫印跡技術(shù)對BKca通道α、β亞單位的蛋白表達改變進行比較，明確BKca蛋白表達和功能活動的改變以及與高興奮狀態(tài)的關(guān)系。 材料和方法： 1.采用近端尿道不全結(jié)扎法制作PBOO性雌性大鼠DO動物模型；

8、2.模型制作后6-8周應用尿流動力儀充盈性膀胱測壓篩選DO模型和對照。出現(xiàn)膀胱非排尿性收縮的尿道結(jié)扎大鼠作為DO組，無非排尿性收縮表現(xiàn)的正常同齡大鼠作為對照組； 3.采用消化酶法急性分離適合膜片鉗技術(shù)的單個逼尿肌細胞； 4.用以兩性霉素B為穿孔劑的穿孔膜片鉗電流鉗下記錄逼尿肌細胞的靜息電位、輸入膜阻抗、閾刺激、動作電位閾電位等指標； 5.用穿孔膜片鉗全細胞電壓鉗下記錄逼尿肌L和T型鈣通道的峰值電流密度以及激活曲線

9、、穩(wěn)態(tài)失活曲線，及藥理學特性； 6.觀察L和T型鈣通道阻斷劑對Fluo-4AM鈣熒光探針標記的逼尿肌細胞靜息鈣濃度的影響； 7.在穿孔膜片鉗全細胞電壓鉗模式下記錄BKca全細胞電流和STOCs電流，分析全細胞電流密度，STOCs平均電流幅度及平均發(fā)放頻率。 8.應用inside-out膜片記錄逼尿肌BKca單通道電流，并對單通道特性進行電學和藥理學鑒定，分析開放概率、平均開放時間、平均關(guān)閉時間、電導等參數(shù)；

10、 9.應用western blot技術(shù)對BKcaα、β亞單位蛋白表達情況進行比較。 結(jié)果： (一)成功建立了大鼠BOO性DO動物模型，模型成功率高達82.3％。 (二)成功建立了一種逼尿肌細胞急性酶分離方法，具有重復性好、操作簡單的優(yōu)點，并且適于膜片鉗研究。 (三)成功地將穿孔膜片鉗技術(shù)技術(shù)應用在大鼠逼尿肌膜電位記錄上，最大程度地反應了逼尿肌的電生理特性。 (四)對DO和正常逼尿肌細胞興奮性進行

11、了各預設指標的檢查，結(jié)果分析表明，BOO性DO逼尿肌細胞興奮性較正常顯著增加，這可能是DO發(fā)生的重要原因。 (五)首次成功地進行了逼尿肌細胞的穿孔膜片鉗電壓依賴性鈣通道電流的記錄 (六)DO逼尿肌L型鈣通道發(fā)生變化，表現(xiàn)為： 1.通道的密度顯著增加，激活后可引起更多的鈣內(nèi)流，這可能是DO后逼尿肌收縮力增強的原因之一。 2.通道失活曲線右移，處于失活狀態(tài)的L型鈣通道比例減少，提示：L型鈣通道阻斷劑需要使用更

12、大的濃度才能將其完全抑制。 (七)DO逼尿肌T型鈣通道發(fā)生變化，表現(xiàn)為： 1.通道的密度顯著增加。 2.通道失活曲線右移，激活曲線左移使得靜息狀態(tài)下T通道的“windowcurrent”(窗電流)增大，這是DO逼尿肌靜息鈣濃度增加的重要原因之一； 3.通道激活曲線左移，這可能是DO興奮性增加的重要原因。 4.T型鈣通道對于正常和DO逼尿肌中的靜息鈣濃度均有顯著的調(diào)控作用，這是通過其窗電流實現(xiàn)的。使

13、用T型鈣通道阻斷劑后，鈣熒光的前后變化率DO逼尿肌大于正常逼尿肌，證明T型鈣通道形成窗電流在DO逼尿肌是上調(diào)的。 (八)DO逼尿肌BKca全細胞電流密度顯著下降。 (九)DO逼尿肌BKca單通道活動顯著下降，具體為開放概率、平均開放時間下降而平均關(guān)閉時間以及單通道電導未發(fā)生改變。同時，單通道對鈣敏感性下降。 (十)DO逼尿肌瞬時外向鉀電流(STOCs)的幅度以及頻率顯著下降.。 (十一)DO逼尿肌BKca

14、通道α、β亞單位蛋白表達顯著下降。 結(jié)論： 一、梗阻性DO逼尿肌細胞興奮性顯著高于正常逼尿肌，這可能是BOO后發(fā)生DO的重要原因。 二、DO逼尿肌細胞L和T性鈣通道密度增加，動力學發(fā)生諸多改變。這些改變易化了DO逼尿肌產(chǎn)生動作電位的能力，是其興奮性升高的重要離子基礎。 三、DO逼尿肌中BKCa通道的蛋白表達和通道活動均出現(xiàn)顯著的削弱，這使得其抑制細胞興奮的能力嚴重減弱，這些變化也是DO逼尿肌興奮性升高重要