1、研究背景: 組織工程是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，對(duì)病損組織結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)與重建進(jìn)行研究開(kāi)發(fā)的一門(mén)新興學(xué)科。 對(duì)血循環(huán)的重建而言，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性絲裂原是血管形成最重要的調(diào)節(jié)因子，在新生血管形成過(guò)程中起重要作用[2]，而通過(guò)將VEGF編碼基因?qū)爰?xì)胞的基因修飾已成為獲得血循環(huán)重建的最具發(fā)展?jié)摿Φ闹委熌Ｊ街弧?

2、 國(guó)外有些研究機(jī)構(gòu)開(kāi)始嘗試將細(xì)胞移植與生長(zhǎng)因子聯(lián)合應(yīng)用，并獲得很好的療效[3]。 研究目的: 1.研究從成人脂肪抽吸物液體部分中獲取的脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞(adipose-derivedstemcell，ASCs)作為脂肪組織工程理想種子細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)。 2.對(duì)ASCs進(jìn)行腺病毒重組增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(recombinedadenovirus-enhancedgreenfluorescentprotein，Ad-EGF

3、P)體外轉(zhuǎn)染和標(biāo)記，觀察其對(duì)細(xì)胞生物性狀的影響，為脂肪干細(xì)胞研究尋找理想的細(xì)胞標(biāo)記方法。 3.探討腺病毒為載體對(duì)種子細(xì)胞進(jìn)行VEGF165基因修飾的可行性。 4.利用I型膠原蛋白作支架材料和ASCs在體內(nèi)構(gòu)建組織工程化脂肪的可行性。 5.通過(guò)VEGF165基因修飾干預(yù)組織工程脂肪組織血管形成，評(píng)價(jià)促進(jìn)組織工程脂肪血管形成的效果，使再生的脂肪組織內(nèi)部獲得血供能力而保證其長(zhǎng)期穩(wěn)定存活，提高組織工程化脂肪成活水平。

4、 材料與方法: 1.ASCs的分離培養(yǎng)及鑒定取人吸脂術(shù)抽吸物的液體部分，使用直接離心過(guò)濾法進(jìn)行原代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)及功能變化，細(xì)胞傳至第4代后供實(shí)驗(yàn)用。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面部分與干細(xì)胞相關(guān)的分子，確定細(xì)胞類型；臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)細(xì)胞活性并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外定向成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化，并以油紅0染色、茜素紅染色和阿新藍(lán)染色進(jìn)行鑒定。 2.Ad.E6FP轉(zhuǎn)染并標(biāo)記ASCsAd.EGFP按不同感染

5、復(fù)數(shù)(multiphciyofinfection，MOI)值體外轉(zhuǎn)染ASCs，進(jìn)行EGFP熒光標(biāo)記，倒置顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及傳代后熒光強(qiáng)度的變化；測(cè)定腺病毒轉(zhuǎn)染ASCs的效率；檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記后成脂能力。使用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活力和繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，同時(shí)將培養(yǎng)細(xì)胞上清液進(jìn)行乳酸脫氫酶(LDH)含量測(cè)定，檢測(cè)Ad.EGFP對(duì)細(xì)胞的毒性。 3.Ad.VEGF165基因轉(zhuǎn)染ASCs后目的基因表達(dá)按上述試驗(yàn)確定的MOI值(

6、50)進(jìn)行Ad.VEGF165體外轉(zhuǎn)染ASCs，通過(guò)免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)VEGF在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況；同時(shí)利用ELISA測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF濃度水平。 4.I型膠原構(gòu)建工程化脂肪的實(shí)驗(yàn)研究將脂肪干細(xì)胞接種于支架材料形成復(fù)合物，將培養(yǎng)細(xì)胞上清液進(jìn)行乳酸脫氫酶(LDH)含量測(cè)定，檢測(cè)材料的細(xì)胞毒性；細(xì)胞-支架粘附率檢測(cè)；最后掃描電鏡觀察細(xì)胞與載體的黏附性。在確定細(xì)胞和支架材料生物相容性較好的情況下，準(zhǔn)備三組植入物(細(xì)胞被EGFP標(biāo)

7、記)：Ⅰ組為空支架，Ⅱ組為ASCs和支架，Ⅲ組為成脂分化的ASCs和支架，分別在不同部位植入同一裸鼠皮下。在8w取新生標(biāo)本，進(jìn)行組織工程新生物大體觀察和濕重測(cè)定后，熒光顯微鏡觀察大體組織標(biāo)本，最后組織學(xué)檢測(cè)、油紅0染色定性。 5.VEGF165促進(jìn)工程化脂肪血管新生準(zhǔn)備三組植入物：IV組為成脂分化的ASCs和支架，V組為EGFP基因轉(zhuǎn)染的ASCs、成脂分化的ASCs和支架，VⅠ組為VEGF165基因轉(zhuǎn)染的ASCs、成脂分化的AS

8、Cs和支架。分別植入同一裸鼠皮下。按2w、12w取新生標(biāo)本，通過(guò)大體觀察、HE染色和免疫熒光觀察新生組織結(jié)構(gòu)和血管生長(zhǎng)情況。 結(jié)果: 1.吸脂物液態(tài)部分分離培養(yǎng)的ASCs形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞，具有很強(qiáng)的增殖及多向分化能力。在脂肪、成骨及成軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，分化出成熟的脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，油紅0、茜素紅染色和阿新藍(lán)染色陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到細(xì)胞表面抗原分子CD29、CD44持續(xù)表達(dá)，說(shuō)明ASCs具有干細(xì)胞特性

9、。 2.Ad.EGFP可成功進(jìn)入AASCs。24h可見(jiàn)綠色熒光，5d熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯較高，ASCs傳代后仍有強(qiáng)熒光表達(dá)。轉(zhuǎn)染ASCs后，不影響其增殖活性。MOI為0、10、20、30、50、100時(shí)轉(zhuǎn)染率分別為0％，10.3％，26.6％，47.6％，94.7％，96.8％。 3.經(jīng)免疫熒光和ELISA檢測(cè)證實(shí)腺病毒能成功地將人VEGF165基因轉(zhuǎn)染至人ASCs中，并獲得有效的表達(dá)。 4.支架與ASCs有良好的相

10、容性及黏附性，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，不影響細(xì)胞增殖。8w時(shí)，Ⅰ組植入物已降解，II和Ⅲ組均有新生組織形成，Ⅱ組新生物平均濕重為18.83±0.71mg，Ⅲ組新生物平均濕重為21.10±1.16mg；Ⅲ組比Ⅱ組形成的脂肪組織結(jié)構(gòu)更完整及更多。II和Ⅲ組相互間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。常規(guī)病理切片及油紅0染色均證實(shí)有脂肪組織形成，EGFP熒光顯色陽(yáng)性。 5.術(shù)后2w，IV、V、VⅠ組的脂肪組織存活濕重分別為20.85±1.35mg，2

11、2.52±0.75mg，22.95±0.79mg。IV與VⅠ組，P<0.01；IV與V組P<0.05；V與VⅠ組，P>0.05。血管計(jì)數(shù)顯示：組IV的血管密度為6.50±2.07個(gè)／HPF；組V為9.56±2.73個(gè)／HPF；組VI為12.00±2.45個(gè)／HPF。術(shù)后12w，IV、V、VⅠ組的脂肪組織存活濕重分別為13.53±1.16mg，21.20±1.00mg，22.80±0.72mg;IV與V、VⅠ組，P<0.01；V與VⅠ組，

12、P<0.05；VⅠ組與V組脂肪組織血管密度有顯著差異(P<0.01)，均高于IV(P<0.01)。血管計(jì)數(shù)顯示：11.11±1.94個(gè)／HPF；組V為15.55±2.77個(gè)／HPF；組VI為18.39±3.73個(gè)／HPF。在體內(nèi)，ASCs這些細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記--CD31，參與血管的形成。 討論: 種子細(xì)胞的大量獲取是構(gòu)建組織工程脂肪核心問(wèn)題之一。在脂肪組織中已被證實(shí)包含具有多向分化潛力的細(xì)胞，并有研究已經(jīng)證實(shí)在脂

13、肪基質(zhì)中包含有多能干細(xì)胞。這種干細(xì)胞被命名為脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞，縮寫(xiě)為ASCs。本實(shí)驗(yàn)從抽脂術(shù)液態(tài)部分成功獲取ASCs。ASCs作為種子細(xì)胞與其他細(xì)胞相比具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)越性，該細(xì)胞來(lái)源廣泛、取材容易，大量獲取，受干擾小。 組織工程另一核心內(nèi)容是尋找具有組織再生潛力的支架材料。在生物材料方面，己開(kāi)發(fā)和研制了適用于不同組織構(gòu)建的生物支架材料。各類材料都具有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，而膠原蛋白在組織工程構(gòu)建中作為支架材料的效果已被肯定。在這個(gè)實(shí)

14、驗(yàn)中，顯示膠原蛋白作為支架材料與ASCs有良好的相容性及黏附性，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，不影響細(xì)胞增殖。 同時(shí)，細(xì)胞標(biāo)記一直是困擾組織工程技術(shù)修復(fù)機(jī)制研究的一大難題，其在干細(xì)胞來(lái)源的種子細(xì)胞的缺損修復(fù)研究中尤為重要。尋找一種直觀、長(zhǎng)期穩(wěn)定，同時(shí)不影響細(xì)胞組織形成能力的標(biāo)記方法非常重要。在本實(shí)驗(yàn)中，EGFP對(duì)ASCs成功進(jìn)行了標(biāo)記，且具有上述優(yōu)點(diǎn)。 另外，VEGF應(yīng)用方式一般可分為直接應(yīng)用和間接應(yīng)用。直接應(yīng)用VEGF有其局限性：①V

15、EGF價(jià)格昂貴；②難以在體內(nèi)保持持續(xù)的有效濃度；③不能自我調(diào)節(jié)。若因子不能持續(xù)有效地支持新生血管網(wǎng)的形成，就不能防止血管形成后的退化和塌陷。而間接應(yīng)用是利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將基因整合進(jìn)宿主細(xì)胞，將一些能產(chǎn)生VEGF的細(xì)胞種植在局部組織，使其在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)、穩(wěn)定地產(chǎn)生VEGF。能很好地克服直接應(yīng)用的缺陷。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，通過(guò)基因載體--腺病毒把VEGF165基因成功轉(zhuǎn)入ASCs內(nèi)，ASCs能大量、穩(wěn)定且持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間分泌V

16、EGF。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)腺病毒介導(dǎo)，將VEGF165基因轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的人ASCs中，應(yīng)用脂肪組織工程植入物聯(lián)合移植裸鼠皮下的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，發(fā)揮了基因的治療性血管形成作用，促進(jìn)了工程化脂肪組織的血管新生，血供的及時(shí)重建，進(jìn)而提高其移植存活水平及存活質(zhì)量。同時(shí)通過(guò)大體標(biāo)本及組織學(xué)檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)有血管瘤等病變發(fā)生，提示此治療是安全的。 結(jié)論： 1.從成人脂肪抽吸物液體部分中獲取的ASCs，從采集到培養(yǎng)都具有明顯優(yōu)

17、勢(shì)，將會(huì)為脂肪組織工程提供比較理想的種子細(xì)胞。 2.腺病毒是較好的基因載體，是一個(gè)高效、安全快捷的基因修飾操作系統(tǒng)，EGFP在ASCs中能持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，將為基因治療和細(xì)胞示蹤提供有效的實(shí)驗(yàn)方法。 3.轉(zhuǎn)染VEGF165基因的ASCs能大量、穩(wěn)定且持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間分泌VEGF，能為血管形成提供豐富穩(wěn)定的血管生成因子。 4.從抽脂術(shù)液態(tài)部分獲取的ASCs能夠滿足脂肪組織工程的種子細(xì)胞要求，而所選用的I型膠原支架能在裸鼠體