1、目的：
　　從人脂肪組織中提取培養(yǎng)脂肪組織來源干細胞(Adipose Tissue DerivedStromal Cells，ADSCs)，了解其生物學特性；從人血管組織中分離提取血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)，并與含綠色熒光蛋白的雙順反子表達載體連接成重組質粒pSELECT-GFPzeo-VEGF，將其分別轉染分離培養(yǎng)的不同代ADSCs，檢測轉染后的ADSCs對

2、VEGF mRNA的表達、VEGF蛋白水平的變化以及成骨活性。
　　方法：
　　膠原酶消化脂肪獲取細胞后，接種于培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)傳代。通過流式細胞儀鑒定體外培養(yǎng)細胞的表面標志，觀察其形態(tài)學特點，測定培養(yǎng)細胞的生長曲線。選取第2代ADSCs分別于條件培養(yǎng)基進行成脂、成骨及成軟骨誘導分化，并分別采用油紅“O”、Von Kossa染色、堿性磷酸酶染色及甲苯胺藍進行染色。另外，采用Trizol法提取人血管組織總RNA，逆轉錄合成cD

3、NA，通過巢式PCR從cDNA中擴增編碼VEGF成熟肽的基因序列，將獲得的目的基因VEGF與pGEM-T Easy線性載體進行連接，再將連接成功的質粒載體轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，經鑒定測序，進行回收。然后對重組克隆載體pTA2-VEGF和含綠色熒光蛋白的雙順反子表達載體pSELECT-GFPzeo-mcs進行酶切處理和連接以獲得重組表質粒pSELECT-GFPzeo-VEGF，經再次鑒定測序，大量回收。最后經脂質體介導將重組表質粒p

4、SELECT-GFPzeo-VEGF分別轉染第2、3、4、5代ADSCs，并進行免疫熒光鑒定，經RT-PCR檢測VEGF mRNA的表達水平。轉染后分別于6h、12h、48h、72h回收轉染組和空載體轉染組ADSCs上清液，采用ELISA對VEGF的分泌進行定量檢測，并進行統(tǒng)計學分析。另外，取第2代轉染后的ADSCs設為VEGF基因轉染組，另建兩對照組分別為空載體轉染組和空白細胞組，分別于成骨條件下進行培養(yǎng)，檢測上清液中堿性磷酸酶、骨鈣

5、蛋白以及層粘連蛋白的分泌水平。
　　結果：
　　膠原酶消化結合密度梯度離心及差速貼壁培養(yǎng)法分離出的細胞表面標記CD49d和CD44等呈現(xiàn)陽性表達，為具有干細胞特性的ADSCs。ADSCs于條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后，經染色證實具有成脂、成骨及成軟骨等多分化潛能。VEGF可以與含綠色熒光蛋白雙順反子表達載體成功構建為重組質粒pSELECT-GFPzeo-VEGF。熒光顯微鏡提示脂質體介導的VEGF目的基因片段能夠成功轉染至體外培養(yǎng)的AD

6、SCs；經ELISA定量檢測，上清液中VEGF mRNA表達水平在轉染組顯著增高，空載體轉染組無明顯變化，經統(tǒng)計學分析P<0.05，具有明顯統(tǒng)計學差異。成骨條件培養(yǎng)下，VEGF轉染后的ADSCs組對堿性磷酸酶、骨鈣蛋白及層粘連蛋白的分泌量明顯高于未轉染組及空轉染組(P<0.05)，具有明顯統(tǒng)計學差異。
　　結論：
　　膠原酶消化結合密度梯度離心法及差速貼壁培養(yǎng)法可有效地從脂肪組織中獲得具有定向誘導分化能力的ADSCs。經脂質

7、體介導可成功將人VEGF目的基因片段轉染至人ADSCs，并能夠在體外持續(xù)有效的表達具有生物學活性的VEGFmRNA，分泌VEGF蛋白。在成骨條件培養(yǎng)下轉染后的ADSCs能夠大量分泌堿性磷酸酶、骨鈣蛋白以及層粘連蛋白，其成骨能力明顯增強。本試驗可以將促血管治療和干細胞移植有效結合起來，轉染后的ADSCs可以有效促進成骨及成血管化，并可以更好的粘附于支架材料，用以修飾構建組織工程骨與軟骨進行體內修復，從而對骨折不愈合、延遲愈合或骨缺損等的治