1、目的：探討JWA基因在腫瘤細(xì)胞遷移過程中的作用以及相關(guān)的分子機(jī)制，為進(jìn)一步深入了解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后，為腫瘤的預(yù)防、診斷和治療提供新的科學(xué)依據(jù)。 方法：HeLa(人宮頸癌細(xì)胞)、B16(小鼠黑色素瘤細(xì)胞)以及HCCLM3(高轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞)都是體外研究腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的良好實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀１狙芯坷眠@些細(xì)胞在特定的促癌或抑癌劑誘導(dǎo)下細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白絲重組和遷移能力改變的特性，建立系列體外遷移模型。 結(jié)果：

2、(1)JWA是新的微管相關(guān)蛋白，為了解JWA是否類似于傳統(tǒng)的MAP，具有肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合蛋白的功能，用JWA反義寡核苷酸處理細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后，得到穩(wěn)定的JWA表達(dá)缺陷水平的HeLa細(xì)胞株(As-HeLa細(xì)胞)，再觀察對細(xì)胞肌動(dòng)蛋白絲重組的影響。結(jié)果顯示在穩(wěn)定JWA表達(dá)缺陷的HeLa細(xì)胞株中，肌動(dòng)蛋白絲開始重組，細(xì)胞的邊緣隨之伸出一些突觸，提示JWA可能是微管和肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架組裝。 (2)在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利

3、用促癌劑佛波酯(phorbol ester, PMA)和抑癌劑三氧化二砷(arsenic trioxide，AS<,2>O<,3>)分別誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞株肌動(dòng)蛋白絲重組的細(xì)胞模型：8nMPMA分別處理細(xì)胞6，12和24h，免疫熒光顯示，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染JWA空載體(HteLa-vector細(xì)胞)的細(xì)胞株中，PMA處理6h后，細(xì)胞邊緣仍未發(fā)現(xiàn)突觸的形成，肌動(dòng)蛋白絲并未出現(xiàn)解聚，提示空載體細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白絲未發(fā)生明顯的解聚聚合。而PMA處理12h后

4、，觀察到細(xì)胞學(xué)形態(tài)發(fā)生改變，肌動(dòng)蛋白絲開始重組。 (3)為了解JWA是否參與腫瘤細(xì)胞的遷移，HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-C1，pEGFP-C1-JWA或pEGFP-C1-AsJWA質(zhì)粒，G418穩(wěn)定篩選后，得到空載體，JWA高表達(dá)(HeLa-JWA細(xì)胞)和反義JWA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，免疫印跡鑒定，建立劃痕和細(xì)胞穿孔試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察JWA對細(xì)胞遷移能力的影響。在劃痕模型中結(jié)果顯示，JWA表達(dá)缺陷可促進(jìn)細(xì)胞的傷口愈合，而JWA高表達(dá)則

5、抑制傷口的愈合，表明JWA在細(xì)胞的非定向遷移中起作用。同樣，細(xì)胞穿孔實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JWA表達(dá)缺陷可促進(jìn)細(xì)胞的遷移，而高表達(dá)的細(xì)胞則起抑制遷移的作用，表明JWA在細(xì)胞的定向遷移中起作用。我們用細(xì)胞穿孔模型檢測了在HCCILM3和B16細(xì)胞株中JWA的作用，結(jié)果觀察到類似的現(xiàn)象，進(jìn)一步提示JWA在腫瘤細(xì)胞的遷移中起重要的作用，JWA可抑制細(xì)胞的遷移。 (4)為建立AS<,2>O<,3>誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的模型，首先用細(xì)胞增殖分析試劑盒分析

6、AS<,2>O<,3>的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，不同濃度的．AS<,2>O<,3>處理空載體和反義JWA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞48h后，有血清處理的細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，2 μM AS<,2>O<,3>處理的HeLa細(xì)胞大約50％出現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象；但在無血清的情況下，AS<,2>O<,3>濃度低于2μM誘導(dǎo)并未觀察到抑制增殖和促進(jìn)凋亡現(xiàn)象。 (5)不同濃度AS<,2>O<,3>對細(xì)胞遷移作用有著不同的影響：用0.5，1和2μM

7、AS<,2>O<,3>處理空載體細(xì)胞0，1和2d后，劃痕結(jié)果顯示AS<,2>O<,3>有顯著抑制HeLa細(xì)胞傷口愈合的作用，且呈劑量依賴性關(guān)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PMA(80nM)能夠顯著增強(qiáng)AS<,2>O<,3>抑制細(xì)胞遷移的作用，而對AS<,2>O<,3>誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和生長抑制沒有顯著影響。 (6)為探討JWA參與細(xì)胞遷移的調(diào)控機(jī)制，考慮到藥物誘導(dǎo)遷移的有效性及對細(xì)胞的毒性作用，選用PMA(80nM)與1 μM AS<,2>

8、O<,3>序貫處理空載體和反義JWA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞。結(jié)果表明PMA能夠顯著增強(qiáng)HeLa細(xì)胞的遷移能力，而AS<,2>O<,3>則明顯抑制PMA誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞遷移，JWA基因表達(dá)下調(diào)后，能顯著減弱AS<,2>O<,3>對HeLa細(xì)胞遷移的抑制作用，同時(shí)促進(jìn)PMA誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移，這些結(jié)果進(jìn)一步證明JWA可能作為信號分子參與細(xì)胞遷移的信號通路調(diào)控。 (7)在此基礎(chǔ)上，為了解JWA是否為模型藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移信號通路所必須，

9、在上述藥物誘導(dǎo)遷移的細(xì)胞模型中，用westem blot檢測絲裂原活化蛋白激酶信號通路(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路級聯(lián)中各級信號分子，結(jié)果顯示在AS<,2>O<,3>和PMA影響HeLa細(xì)胞遷移模型中，Raf-MEK-ERK．信號途徑被激活(即Raf、MEK、ERK磷酸化)，JWA基因表達(dá)下調(diào)后，MEK和ERK不能被磷酸化，但Raf的磷酸化未受到影響. (8)為闡明JWA

10、在模型藥物激活的MEK-ERK信號通路中的作用，本文設(shè)計(jì)了JWA回復(fù)模型。JWA表達(dá)缺陷的HeLa細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)pEGFP-C1-JWA的質(zhì)粒后得到JWA回復(fù)的HeLa細(xì)胞(As-HeLa-rescue細(xì)胞)?；貜?fù)模型中，PMA(80 nM)加或不加AS<,2>O<,3>(1 μM)處理空載體和JWA回復(fù)的細(xì)胞24h后，用westem blot檢測Raf-MEK-ERK的磷酸化。結(jié)果顯示，JWA回復(fù)細(xì)胞中，AS<,2>O<,3>和PMA誘導(dǎo)的

11、MEK-ERK信號途徑被激活，MEK和ERK的磷酸化被回復(fù)，但Raf的磷酸化回復(fù)并未受到影響，進(jìn)一步證明JWA通過MEK-ERK級聯(lián)影響細(xì)胞遷移。 (9)PMA和AS<,2>O<,3>獨(dú)立作用時(shí)均能激活MEK/ERK信號通路，但兩者對HeLa細(xì)胞遷移的影響完全相反(PMA促進(jìn)遷移，AS<,2>O<,3>抑制遷移)。為了解JWA是否參與激活了ERK不同的磷酸化位點(diǎn)，進(jìn)而激活其下游不同的底物，我們用westem blot檢測了遷移模

12、型中AS<,2>O<,3>和PMA誘導(dǎo)的ERK下游不同的底物黏著斑激酶(focal adhesionkinase，F(xiàn)AK)和環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)的表達(dá)。結(jié)果顯示AS<,2>O<,3>可下調(diào)FAK的表達(dá)水平而PMA可上調(diào)COX-2的表達(dá)水平。進(jìn)一步檢測JWA在PMA調(diào)節(jié)COX-2的表達(dá)和AS<,2>O<,3>調(diào)節(jié)FAK表達(dá)中的作用，結(jié)果顯示，在AS<,2>O<,3>和PMA影響HeLa細(xì)胞遷移模型中，

13、用PMA(80 nM)處理JWA表達(dá)缺陷細(xì)胞株后，其相應(yīng)的ERK下游底物COX-2的表達(dá)水平顯著上調(diào)。而AS<,2>O<,3>(1μM)處理則引起其相應(yīng)的ERK下游底物FAK表達(dá)的上調(diào)。這些結(jié)果證明JWA與PMA/AS<,2>O<,3>激活的MEK-ERK通路，分別調(diào)節(jié)其相應(yīng)的ERK下游底物COX-2/FAK的表達(dá)，最終引起遷移的不同效應(yīng)。 (10)用JWA回復(fù)模型進(jìn)一步驗(yàn)證JWA在PMA調(diào)節(jié)COX-2的表達(dá)和AS<,2>O<,

14、3>調(diào)節(jié)FAK表達(dá)中的作用。用PMA(80 nM)加或不加AS<,2>O<,3>(1 μM)處理空載體和JWA回復(fù)的細(xì)胞24h后，用western blot檢測COX-2和FAK的表達(dá)。結(jié)果顯示，隨著JWA表達(dá)水平的回復(fù)，COX-2和FAK的表達(dá)均被回復(fù)。以上結(jié)果提示JWA在PMA和AS<,2>O<,3>誘導(dǎo)的MEK-ERK-下游底物通路中起重要作用。 (11)為探討JWA是否在MAPK級聯(lián)中起類似激酶分子的作用，本文設(shè)計(jì)了系列

15、JWA磷酸化位點(diǎn)突變體。利用基因突變技術(shù)，構(gòu)建了JWA編碼區(qū)PKC磷酸化位點(diǎn)l、2以及兩位點(diǎn)同時(shí)突變的三種pEGFP-N1載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，獲得相應(yīng)的三種HeLa細(xì)胞株，分別命名為As-HeLa-P1，As-HeLa-P2和As-HeLa-P12細(xì)胞株。結(jié)果說明JWA在AS<,2>O<,3>和PMA引起的MEK-ERK通路中起重要作用，提示JWA在MAPK通路中可能是介于Raf和MEK的磷酸化底物。 (12)為進(jìn)一步證實(shí)JWA磷酸

16、化在遷移中所起的作用，用PMA(80nM)加或不加AS<,2>O<,3>(1μM)分別處理As-HeLa-P12和As-HeLa-rescue細(xì)胞后，細(xì)胞穿孔試驗(yàn)檢測其遷移能力的改變。結(jié)果顯示，在As-HeLa-rescue細(xì)胞中，AS<,2>O<,3>和PMA誘導(dǎo)的遷移被回復(fù)，As-HeLa-P12細(xì)胞中結(jié)果則相反。因此，JWA蛋白磷酸化位點(diǎn)突變對調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移起著重要的作用，但確切證據(jù)有待進(jìn)一步研究提供。 討論：JWA 參與腫

17、瘤細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)，是促癌或抑癌劑誘導(dǎo)細(xì)胞遷移信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中共同的信號分子，在MAPK信號通路以及肌動(dòng)蛋白絲的重組過程中起重要的作用。JWA可能是細(xì)胞內(nèi)控制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移新的分子標(biāo)志物。JWA可以抑制HeLa,HCCLM3和B16等腫瘤細(xì)胞的遷移，可能在信號通路中同時(shí)調(diào)控微管和肌動(dòng)蛋白絲兩大細(xì)胞骨架系統(tǒng)，引起遷移。在HeLa細(xì)胞中，JWA通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白絲的重組抑制細(xì)胞的遷移；在抑癌劑AS<,2>O<,3>和促癌劑PMA誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋