1、目的：
　　急性肺損傷（acute lung injury, ALI）是各種肺內外因素引起的急性彌漫性肺組織損傷，其主要特點是肺部過度炎癥反應和肺血管通透性增加。革蘭氏陰性細菌感染是ALI的常見病因之一。細菌內毒素的主要活性成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可由其受體介導直接激活肺內炎癥細胞，釋放大量炎癥介質，并由此引發(fā)瀑布式炎癥反應，導致彌漫性肺組織損傷。ALI持續(xù)發(fā)展可導致急性呼吸窘迫綜合征甚至多系統(tǒng)器

2、官功能衰竭。盡管近年來各種支持療法有了很大進展，但ALI的具體發(fā)病機制至今尚未完全闡明，病死率仍高達40％以上。目前大部分觀點認為中性粒細胞的活化，炎癥因子和炎癥介質的大量釋放，氧化應激反應，細胞凋亡等在內毒素性肺損傷的發(fā)病機制中起了重要的作用，而肺內過度的失控的炎癥反應是導致ALI的根本原因。
　　在缺血或炎癥等病理情況下，體內會大量產生自由基并導致細胞氧化損傷，過量產生的氧自由基會導致DNA、脂質和蛋白的氧化損傷，其中羥自由基

3、(·OH)的毒性最強，并且到目前為止還沒有發(fā)現哺乳動物體內內源性針對·OH的清除途徑。近來，Ohsawa等發(fā)現了氫氣分子可選擇性清除細胞體系中的·OH，動物呼吸氣體中一定濃度的氫氣可以有效緩解腦缺血再灌注損傷[1]。在生物體內，氫氣可以發(fā)揮抗氧化作用，保護多種細胞和組織器官免受過氧化損傷。另外，氫氣分子在肝臟、腎臟及內分泌系統(tǒng)等方面均有保護作用。有研究認為氫預處理對缺血/再灌注所致ALI具有保護作用，能抑制氧化應激反應，提高肺組織SOD

4、活性，降低MDA、MPO及細胞因子的表達，降低肺組織病理損害，這一啟動機體內源性保護的作用已初見端倪，但其詳細作用機制仍有待進一步探討。并且氫后處理對ALI是否起到相同的作用也值得近一步研究。
　　內源性氣體信號分子之間存在著相互調節(jié)的關系。已有研究證實CO、NO與H2S之間可對彼此產生的限速酶進行調節(jié)，而關于H2與他們之間相互關系的報道尚不多見。CO已被證實可減輕LPS所致的肺損傷，尤其對PMN的浸潤有明顯的抑制作用[12]。機

5、體內源性CO主要由HO催化血紅素降解產生。誘導型HO，即HO-1，又稱為熱休克蛋白32，可作為保護性蛋白被細菌內毒素、炎性細胞因子、血紅素及其降解產物、NO、低氧、高氧等多種因素誘導表達，保護組織免受氧化應激損傷。而關于ALI時CO與氫之間相互關系如何，尚未見相關報道。另外，研究表明，HO-1是一種內源性的細胞保護蛋白，具有抗氧化應激、抗炎、抗細胞凋亡的作用。那么，在H2對ALI的作用中，HO-1/CO發(fā)揮了何種作用？這也是我們感興趣的

6、問題之一。有研究表明HO-1的誘導表達可降低實驗動物對致死劑量LPS的敏感性，提高生存率?？梢奌O-1/CO通路在對抗內毒素導致的組織損傷中具有重要作用。H2對HO-1/CO通路是否有調節(jié)作用，作用機制尚不清楚。
　　P38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)家族中的一員。p38MAPK在凋亡、細胞因子產生、轉錄調節(jié)及缺血再灌注損傷中起重要作用，與炎癥也有密

7、切關系。有文獻報道，P38MAPK介導了某些因素對HO-1的誘導，而H2可激活主動脈平滑肌細胞通路，由此我們推測，P38MAPK可能是CO和H2之間相互調節(jié)的連接紐帶。這是本研究所要解決的另一個問題。
　　為此，本實驗以內毒素誘導急性肺損傷大鼠為模型，探討HO-1在ALI的肺組織中的表達的作用，以及其與炎癥因子和促凋亡因子之間的關系，探討HO-1在富氫水對ALI保護的作用。同時，通過本實驗研究，試圖探討P38MAPK在富氫水對HO

8、-1調節(jié)中的作用，從而為尋求ALI新的防治思路和方法提供實驗基礎和理論依據。
　　方法：
　　1、實驗動物及其模型構建
　　健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重220-250g，腹腔麻醉后，靜脈注射LPS(E.Coli，O55∶B5)10mg/kg,構建ALI大鼠模型。
　　2、肺臟組織光鏡標本的制備與觀察
　　采用4％多聚甲醛溶液固定腫組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚5μm，行HE染色，AX70

9、 OLYMPUS光學顯微鏡觀察、攝片。
　　3、肺臟組織電鏡標本的制備與觀察
　　大鼠放血處死，迅速取出肺臟組織，減壓后固定于4℃、2.5％戊二醛固定液中4h，JEM-1200EX型透射電子顯微鏡下觀察、攝片。
　　4、TNF-α和IL-1定量檢測
　　采用ELISA方法，分別檢測肺組織TNF-α和IL-1分泌水平。酶標儀測定450nm處OD值。結果以試劑盒提供的標準品繪制標準曲線，應用SoftMax Pro4.

10、3.1LS軟件分析，計算細胞因子含量（pg/ml）。
　　5、肺組織中丙二醛(MDA)含量、髓過氧化物酶(MPO)活性測定
　　MDA檢測:取肺組織勻漿0.1ml，加入反應液后測定其在532nm處的吸光度值，考馬斯亮藍蛋白測定法檢測肺組織勻漿液中蛋白濃度。
　　MPO檢測:將肺組織剪碎勻漿，加入反應液0.5％十六烷基三甲基溴化胺溶液，測定其在460nm處30秒到90秒內的光密度值（OD值）變化。
　　6、HO-1

11、、總p38MAPK、磷酸化p38MAPK激酶蛋白表達
　　Westemblot方法檢測肺組織HO-1、總p38MAPK、磷酸化p38MAPK激酶蛋白表達。
　　7、統(tǒng)計學分析
　　實驗數據用SPSS17.0軟件進行分析。兩組間比較用t檢驗，各組件比較采用方差分析，所有數據采用均值±標準差((x)±s)表示，以P＜0.05為統(tǒng)計學上差異有顯著性。
　　結果：
　　1、大鼠生理指標的變化
　　大鼠在給LP

12、S后，MAP均有不同程度的降低，在給藥組大鼠血壓1h后開始明顯下降，內毒素處理組間未達到顯著性水平。對照組的PaO2明顯高于其他各組，PaCO2明顯低于其他各組，其他各組間比較無顯著性差異。對照組的濕-干重比率(W/D)明顯低于其他各組，差別有顯著性意義(P＜0.05)。
　　2、肺臟組織光鏡標本的制備與觀察
　　對照組肺組織內細支氣管及各級分支的形態(tài)結構正常。肺泡壁由肺泡上皮細胞和肺泡隔構成，肺泡隔較窄，其上可見毛細血管;

13、肺泡孔明顯;肺泡腔大小正常，其內未見有炎性細胞和滲出物。LPS處理組可見肺泡腔及肺間質彌漫性炎細胞浸潤，肺泡間隔增寬，部分區(qū)域肺泡隔斷裂，肺泡萎陷、甚至結構消失，部分肺泡內見出血。富氫水處理組上述病變明顯減輕，局部肺組織僅有少量炎細胞浸潤，肺泡隔略有增寬。
　　3、肺臟組織電鏡標本的制備與觀察
　　對照組Ⅱ型肺泡細胞體積較大，呈立方形，細胞表面微絨毛較多。核較大，呈圓形，核內異染色質少。胞質內可見少量嗜鋨性板層小體，其板層清

14、晰，可見線粒體和粗面內質網。內毒素組肺泡Ⅱ型肺泡核膜模糊、水腫，核內染色質邊集、凝聚，線粒體嵴減少，外膜破壞，板層小體大部分排空，部分有存留。富氫水治療組Ⅱ型肺泡核膜較模糊，略有水腫，核內染色質部分邊集、凝聚，線粒體嵴略減少，外膜較完整，板層小體大部分有存留。
　　4、TNF-α和IL-1定量檢測
　　L組、ZnPP、H-ZnPP組明顯高于C組(P＜0.01)，說明LPS造成急性肺損傷模型成立。HL、Hm、和H-Hm治療能明

15、顯降低TNF-α和IL-6的水平。
　　5、肺組織中丙二醛(MDA)含量、髓過氧化物酶(MPO)活性測定
　　與對照組比較，內毒素處理組的MDA和MPO均有所增高，其中以ZnPP組最高。HL、Hm、、H-Hm和HSL組較L組的MDA和MPO明顯降低。
　　6、HO-1、總p38MAPK、磷酸化p38MAPK激酶蛋白表達
　　內毒素處理組HO-1表達均高于C、H組(P＜0.05)，富氫水組HO-1水平要高于內毒素組

16、，說明富氫水能夠進一步上調HO-1的表達。HSL組HO-1表達要高于HL組。與對照組比較，L、HL、HSL組的p-p38均增高;與L組比較，HL、HSL組p-p38降低。
　　結論：
　　1、氧化和抗氧化反映的失衡參與了ALI的發(fā)生機制。
　　2、富氫水和HO-1對ALI大鼠有保護作用。
　　3、富氫水可能通過上調HO-1的表達對大鼠急性肺損傷起到保護作用。
　　4、富氫水能夠抑制p38MAPK信號通路的激