1、SSR標(biāo)記具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、呈共顯性遺傳、數(shù)量豐富和遍布整個(gè)基因組等優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)使得SSR標(biāo)記成為廣泛使用的分子標(biāo)記之一，然而按照傳統(tǒng)的方法開發(fā)SSR標(biāo)記不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且效率低。隨著功能基因組學(xué)的發(fā)展，EST因?yàn)榭梢杂糜谛禄虻陌l(fā)現(xiàn)、基因表達(dá)調(diào)控研究和基因芯片的底物而被大量測(cè)序，并保存在公共序列數(shù)據(jù)庫(kù)中，這些EST為SSR等分子標(biāo)記的開發(fā)提供了豐富的序列資源?；贓ST序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記與傳統(tǒng)的SSR標(biāo)記相比有很多優(yōu)點(diǎn)

2、，如：EST-SSR標(biāo)記在相關(guān)物種之間具有很高的可轉(zhuǎn)移性；EST-SSR標(biāo)記通常都代表著某種功能，這種功能可以通過(guò)序列同源性比對(duì)獲得；由于利用的是公共序列，EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)過(guò)程簡(jiǎn)單成本低；EST-SSR能夠反映出轉(zhuǎn)錄區(qū)的差異，這使得EST-SSR在種質(zhì)遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助選擇和比較作圖等研究中具有更高的使用價(jià)值。 Cucumis屬包括甜瓜和黃瓜兩種重要的蔬菜作物，這兩種蔬菜在世界上廣泛種植，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，開

3、發(fā)黃瓜和甜瓜上可用的EST-SSR標(biāo)記對(duì)于這兩種作物的遺傳育種研究有著重要的意義。利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)對(duì)公共序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的黃瓜和甜瓜EST上的SSR位點(diǎn)進(jìn)行了鑒定和分布特征分析，開發(fā)了42個(gè)具有多態(tài)性的EST-SSR標(biāo)記，評(píng)價(jià)了這些標(biāo)記在Cucumis屬種質(zhì)系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究中的應(yīng)用，獲得了以下結(jié)果： 從GenBank中共獲得了5563條來(lái)自于黃瓜的EST和基因序列以及5748條來(lái)自于甜瓜的EST和基因序列。對(duì)這些序列分別進(jìn)行組裝，獲

4、得3627條黃瓜的Unigene，其覆蓋長(zhǎng)度為2.2Mb；3189 條甜瓜 Unigene，覆蓋長(zhǎng)度為 1.8Mb。以重復(fù)基序長(zhǎng)度為2～6bp、最低重復(fù)次數(shù)5次為標(biāo)準(zhǔn)，在Unigene上搜尋SSR位點(diǎn)，在黃瓜上獲得了479個(gè)SSR位點(diǎn)，其發(fā)生頻率為1/4.6kb；在甜瓜上獲得385個(gè)SSR位點(diǎn)，其發(fā)生頻率為 1/4.7kb。黃瓜和甜瓜的 EST-SSR具有很多共同的特征：在SSR位點(diǎn)中，主要是二核苷酸重復(fù)，其次是三核苷酸重復(fù)；在二核苷酸

5、重復(fù)中，主要的基序類型是AG，其次是AT；在三核苷酸重復(fù)中，主要基序類型是AAG；位于CDS區(qū)的SSR位點(diǎn)數(shù)量最多，其次是5’UTR和3’UTR；卡方檢驗(yàn)表明，三核苷酸基序在CDS區(qū)和UTR區(qū)是隨機(jī)分布的，而二核苷酸基序并不是隨機(jī)分布，其在UTR區(qū)的分布密度要極顯著地高于在CDS區(qū)的分布密度，在甜瓜上3’UTR區(qū)的 EST-SSR數(shù)量要極顯著地高于5’UTR，表明二核苷酸重復(fù)基序和三核苷酸重復(fù)基序在CDS和UTR區(qū)的選擇壓力不同。

6、 在黃瓜上選擇了54個(gè)SSR位點(diǎn)合成側(cè)翼引物，在12個(gè)黃瓜基因型上評(píng)價(jià)這些SSR位點(diǎn)的多態(tài)性，其中有2對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物；3對(duì)引物有非特異性產(chǎn)物；26對(duì)引物擴(kuò)增出了特異性產(chǎn)物，但并無(wú)多態(tài)性；23對(duì)引物在20個(gè)位點(diǎn)上擴(kuò)增出了特異性的具有多態(tài)性的產(chǎn)物。在多態(tài)性EST-SSR位點(diǎn)上最多檢測(cè)到了6個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)能夠檢測(cè)到3.3個(gè)等位基因，平均觀測(cè)雜合度和平均期望雜合度分別為0.404和0.465，有13個(gè)EST-SSR位點(diǎn)顯著地偏離

7、Hardy-Weinberg平衡，有10個(gè)多態(tài)性 EST-SSR位點(diǎn)所在的EST序列與已知的功能基因或核苷酸序列有顯著的同源性。可轉(zhuǎn)移性分析表明，有13個(gè)引物對(duì)在甜瓜上有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，占總數(shù)的65％，其中有7個(gè)(35％)引物對(duì)在測(cè)試的甜瓜基因型上表現(xiàn)出多態(tài)性。在甜瓜上共合成56對(duì)EST-SSR引物，其中4對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物；5對(duì)引物有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；25對(duì)引物有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，但無(wú)多態(tài)性；22對(duì)引物擴(kuò)增出特異性的多態(tài)性產(chǎn)物。這22對(duì)引

8、物在27個(gè)黃瓜基因型上最多檢測(cè)到了5個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到2.9個(gè)等位基因，平均觀測(cè)雜合度為0.340，平均期望雜合度為0.442。有17個(gè) EST-SSR位點(diǎn)顯著的偏離Hardy-Weinberg平衡。在CM01和CM33，CM16和CM33之間有顯著的連鎖不平衡關(guān)系存在。有13個(gè)多態(tài)性EST-SSR位點(diǎn)所在的EST序列與已知的功能基因或核苷酸序列有顯著的同源性?？赊D(zhuǎn)移性分析表明，有15個(gè)引物對(duì)在黃瓜上獲得了特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，占

9、總數(shù)的68.2％。 利用多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記分別對(duì)黃瓜和甜瓜材料的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系進(jìn)行了評(píng)價(jià)。20個(gè)黃瓜EST-SSR 在 12 份黃瓜種質(zhì)上檢測(cè)到的 PIC 值為0.153～0.733，平均PIC值為0.446。12份種質(zhì)兩兩之間的Jaccard相似系數(shù)范圍為0.142～0.935。利用UPGMA法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，可以將12份種質(zhì)顯著地分為歐洲種質(zhì)和我國(guó)種質(zhì)(Bootstrap值大于99％)，主坐標(biāo)分析還可以將我國(guó)黃瓜種質(zhì)進(jìn)