1、鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是一種珍稀名貴的傳統(tǒng)中藥材。為陰生植物，喜生長于溫暖、濕潤的林陰環(huán)境，光合能力較低，對強(qiáng)光敏感，在自然光照下，就會引起石斛發(fā)生光抑制現(xiàn)象，影響光合作用和石斛的正常生長。但是，自然光照對鐵皮石斛產(chǎn)生光抑制的程度和分子機(jī)理還不清楚。
　　一氧化氮(NO)是一種對生物膜高度透過的小分子自由基，在植物多種生理、病理和脅迫過程中發(fā)

2、揮重要作用。適當(dāng)濃度的NO可以緩解逆境脅迫下植物所受的傷害，對植物具有保護(hù)作用。NO對自然光照射下的陰生植物鐵皮石斛是否具有保護(hù)作用及作用機(jī)理，目前還沒有研究。
　　試驗設(shè)遮蔭組A、自然光照組B和NO預(yù)處理后自然光照處理組C三種處理，對三種處理鐵皮石斛葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，比較分析差異表達(dá)基因，結(jié)合生理生化指標(biāo)、光合作用參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化，分析鐵皮石斛光適應(yīng)性的分子機(jī)理，探究NO緩解自然光脅迫的分子機(jī)制，探討遮蔭對石斛生長的重要

3、性，為鐵皮石斛生長光的調(diào)控及人工栽培提供參考。
　　主要結(jié)果如下:
　　1.自然光照4h，B組鐵皮石斛的PSⅡ反應(yīng)中心受到顯著光抑制;在經(jīng)NO預(yù)處理的C組鐵皮石斛中，自然光對PSⅡ反應(yīng)中心的抑制作用得到延遲和緩解，對PSⅡ反應(yīng)中心起到了保護(hù)作用。B組，自然光照4h顯著抑制了Pn，對總?cè)~綠素含量和葉綠素a/b沒有影響，MDA的變化也不顯著。C組，NO預(yù)處理未能改善自然光對Pn的抑制，對總?cè)~綠素含量和葉綠素a/b也沒有影響，暗恢

4、復(fù)20h后，能顯著降低MDA的含量。自然光照4h，B組和C組鐵皮石斛的SOD酶、POD酶和CAT酶活性均顯著降低，C組NO預(yù)處理能顯著緩解自然光對SOD酶和POD酶活性的降低，而對CAT酶活性影響不大。
　　2.鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組測序獲得80267個基因，52652個可靠轉(zhuǎn)錄本，N50為1286bp，其中長度＞2000bp的轉(zhuǎn)錄本有7939個，對可靠轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行ORF預(yù)測得到23401條蛋白序列。將這些蛋白序列與已知蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Bla

5、stp比對，注釋到NR、EggNOG、GO、InterPro、KEGG的分別有20768、16840、12396、17844、20757個轉(zhuǎn)錄本。
　　3.A、B兩組鐵皮石斛共有6087個差異表達(dá)基因(DEG)，A中上調(diào)表達(dá)的有3673個，下調(diào)表達(dá)的有2414個。
　　注釋到GO庫的有1269個轉(zhuǎn)錄本，在A組上調(diào)表達(dá)的有994個，下調(diào)表達(dá)的有275個。在新陳代謝過程、細(xì)胞過程、單有機(jī)體過程、生物調(diào)控、結(jié)合功能和催化功能等GO

6、 term富集了大量轉(zhuǎn)錄本，其中，核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性是富集程度最高的功能條目。
　　有4631個DEG注釋到253個KEGG通路中，類黃酮生物合成通路、植物病原相互作用、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路發(fā)生顯著富集;有1854個差異表達(dá)基因注釋到InterPro庫，在遮蔭組A中上調(diào)表達(dá)的有1376個，下調(diào)表達(dá)的有478個。包含AP2/ERF domain、DNA-binding domain、DNA-bindingWRKY

7、、NAC domain等的轉(zhuǎn)錄因子家族和包含蛋白激酶功能域的基因顯著富集。在顯著差異的115個轉(zhuǎn)錄因子中，102個上調(diào)表達(dá)，13個下調(diào)表達(dá);熒光定量PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果變化趨勢相同，驗證了轉(zhuǎn)錄組測序的準(zhǔn)確性。
　　4.B和C組DEG中除了大分子代謝過程和基因表達(dá)調(diào)控功能發(fā)生富集，同時抗氧化酶活性和防御功能也發(fā)生了富集，具體是通過調(diào)控苯丙烷生物合成、谷胱甘肽代謝、亞油酸α-亞麻酸代謝、黃酮類代謝、植物病原互作、黃酮和黃酮醇生物

8、合成、異喹啉生物堿生物合成、鞘脂類代謝、玉米素生物合成、不飽和脂肪酸生物合成等代謝通路相關(guān)基因的表達(dá)來緩解自然光脅迫對鐵皮石斛的氧化傷害。總之，NO通過調(diào)動鐵皮石斛的抗氧化活性和防御機(jī)制，動員環(huán)境適應(yīng)、初生次生代謝途徑，來消除活性氧，緩解自然光脅迫對光合機(jī)構(gòu)的氧化傷害。
　　5.本研究中克隆了DoSTR，并登陸NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號為KX068707，DoSTR全長1380bp，編碼392個氨基酸。推測的pI是7.64，分子量大約

9、為44.0kD。DoSTR屬于組成型表達(dá)基因，在花中表達(dá)量最高，在莖中表達(dá)量最低。四種誘導(dǎo)子均不同程度地誘導(dǎo)了DoSTR的表達(dá)。煙草葉片的瞬時表達(dá)顯示DoSTR亞細(xì)胞定位于液泡中。
　　綜上所述，本研究初步揭示了鐵皮石斛耐蔭適應(yīng)的機(jī)理，自然光照射鐵皮石斛，引起葉綠素吸收的光能大于光合作用所能利用的光能，一部分過剩光能通過光合機(jī)構(gòu)保護(hù)機(jī)制的運轉(zhuǎn)耗散掉，另一部分過剩光能以過剩電子的形式存在于光合電子傳遞鏈中，進(jìn)而形成活性氧，對光合機(jī)構(gòu)