1、目的:
　　生發(fā)基質(zhì)-腦室內(nèi)出血(germinal matrix hemorrhage-intraventricularhemorrhage，GM-IVH)是早產(chǎn)兒顱內(nèi)出血最常見的類型。在過(guò)去的幾十年中，隨著醫(yī)療技術(shù)水平及護(hù)理水平的提高，早產(chǎn)兒的存活率顯著增加，但對(duì)于孕周小，出生體重低的早產(chǎn)兒而言，GM-IVH的發(fā)病率仍是一個(gè)主要問(wèn)題。GM-IVH可留有不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如癲癇、認(rèn)知異常、腦癱等，因此GM-IVH及其導(dǎo)致的

2、神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥仍然是全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。當(dāng)前對(duì)于GM-IVH后繼發(fā)性腦損傷機(jī)制還不是十分清楚。早產(chǎn)兒發(fā)生GM-IVH后常常合并側(cè)腦室擴(kuò)張，除對(duì)癥治療外，目前尚無(wú)有效的治療手段，腰椎穿刺是主要的對(duì)癥治療方法之一，目的是釋放出聚積在側(cè)腦室內(nèi)和腦脊液中的陳舊出血、增高的蛋白質(zhì)以及過(guò)多的腦脊液，保持腦脊液循環(huán)通路的暢通，防止側(cè)腦室持續(xù)擴(kuò)張，形成嚴(yán)重的腦積水，減輕對(duì)腦組織的壓迫。通過(guò)腰椎穿刺方法，對(duì)引流出的腦脊液進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)十

3、分突出的現(xiàn)象，這類早產(chǎn)兒腦脊液糖的含量持續(xù)低于正常早產(chǎn)兒參考值，但患兒血糖正常，Volpe總結(jié)如下:這種無(wú)法用炎癥解釋的腦脊液糖濃度的降低發(fā)生于出血后第1天，5-15天最明顯，常常持續(xù)數(shù)周，最長(zhǎng)持續(xù)至出血后3個(gè)月。大腦的能量來(lái)源主要依賴于葡萄糖，而葡萄糖從血液進(jìn)入腦細(xì)胞必須通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucosetransport1，GLUT1)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3(glucose transport3，GLUT3)的介導(dǎo)。在先天性GLUT1

4、缺乏癥的患兒中，腦脊液中糖含量低于正常值，而同一時(shí)間的血液中的糖濃度是正常的，腦脊液/血葡萄糖之比降低，乳酸的含量正?；蚪档停珻T、MRI腦部影像學(xué)正常，EEG表現(xiàn)為背景波較慢，多有彌漫性或局灶性的異常放電，患兒常表現(xiàn)為抗癲癇藥物治療無(wú)效的癲癇發(fā)作，發(fā)育遲緩，獲得性小頭畸形，共濟(jì)失調(diào)、智力低下等。目前對(duì)GM-IVH患兒腦脊液糖濃度降低的機(jī)制不清楚，是否參與了繼發(fā)性腦損傷也不清楚？最初認(rèn)為腦脊液糖濃度降低是由于紅細(xì)胞的消耗和無(wú)氧糖酵解的增

5、加，但隨后均因?yàn)槟X脊液紅細(xì)胞清除后和乳酸濃度正常，糖濃度依然持續(xù)在低水平而被否決，有學(xué)者猜測(cè)可能因?yàn)槌鲅茐牧四X內(nèi)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)導(dǎo)致了腦脊液持續(xù)的糖濃度降低。查閱文獻(xiàn)未見相關(guān)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)GM-IVH動(dòng)物模型，應(yīng)用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)方法，定量分析了腦室周圍腦組織GLUT1、GLUT3蛋白的表達(dá)，探討GM-IVH后腦脊液糖濃度降低的可能機(jī)制，為臨床提供新的治療手段開辟思路。
　　方法:
　　1、將懷孕29天的新西蘭孕兔進(jìn)行剖宮產(chǎn)，

6、迅速將幼兔取出，并給予保溫、奶粉喂養(yǎng)。將幼兔隨機(jī)分為兩組，在生后3小時(shí)之內(nèi)，其中一組的早產(chǎn)兔給予50％的丙三醇，劑量按10ml/Kg，經(jīng)腹腔注射，另一組的早產(chǎn)兔不給予任何處理。
　　2、兩組早產(chǎn)兔分別于生后24小時(shí)接受頭顱超聲檢查，觀察GM-IVH發(fā)生情況。選取接受丙三醇注射后發(fā)生GM-IVH的早產(chǎn)兔15只，為模型組，未給予任何處理的未發(fā)生GM-IVH的早產(chǎn)兔15只，為對(duì)照組，然后將兩組分別隨機(jī)分為生后24h、48h、72h三個(gè)亞

7、組，按上述時(shí)間點(diǎn)給予麻醉，由內(nèi)向外迅速選取腦室周邊區(qū)域組織，一部分新鮮腦組織放入4％多聚甲醛溶液中固定，供后期蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，以觀察早產(chǎn)兔發(fā)生重度GM-IVH后，腦組織細(xì)胞形態(tài)的變化，另一部分新鮮腦組織立即用液氮冷凍，然后將標(biāo)本放到-80℃冰箱，供蛋白印跡實(shí)驗(yàn)用，用蛋白印跡法檢測(cè)對(duì)照組與模型組早產(chǎn)兔腦組織的GLUT1蛋白和GLUT3蛋白的表達(dá)。
　　3、統(tǒng)計(jì)方法:采用

8、SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件、Microsoft Excel2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±SD）表示，均數(shù)比較前先行方差齊性檢驗(yàn)，不同時(shí)間點(diǎn)多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用LSD法（Least-significant Difference）檢驗(yàn)，兩個(gè)樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent Samples Test)，若不滿足方差齊性檢驗(yàn)則采用秩和檢驗(yàn)(rank-sum test)的方法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)定為0.05

9、，P值小于0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、成功的建立了早產(chǎn)兔Ⅲ度GM-IVH模型
　　通過(guò)頭顱超聲、大體標(biāo)本觀察、腦組織HE染色觀察證實(shí)早產(chǎn)兔GM-IVH模型的成功制備。
　　2、腦組織GLUT1蛋白的表達(dá)
　　用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)早產(chǎn)兔腦組織GLUT1的表達(dá)，對(duì)照組腦組織標(biāo)本中GLUT1表達(dá)量在生后24h、48h、72h是逐漸減少的，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);模

10、型組早產(chǎn)兔腦組織標(biāo)本中GLUT1表達(dá)量在生后24h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)間兩兩比較亦有差異(P＜0.05)，以生后24h最高，其次是生后48h，最后是生后72h;模型組早產(chǎn)兔腦組織標(biāo)本中GLUT1蛋白量在生后72h低于同一時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組，而生后24小時(shí)、48小時(shí)的蛋白量均高于同一時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3、腦組織GLUT3蛋白的表達(dá)
　　用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)早產(chǎn)兔腦組織GLUT3表達(dá)，對(duì)

11、照組腦組織標(biāo)本中GLUT3表達(dá)量在生后24h、48h、72h是逐漸增多的，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);模型組早產(chǎn)兔腦組織標(biāo)本中GLUT3表達(dá)量在生后24h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)間兩兩比較亦有差異(P＜0.05)，以生后48h最高，其次是生后24h，最后是生后72h，模型組早產(chǎn)兔腦組織標(biāo)本中GLUT3蛋白量在生后24h與對(duì)照驗(yàn)組同一時(shí)間點(diǎn)相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，72h的蛋白量低于同一時(shí)間點(diǎn)

12、的對(duì)照組，而48小時(shí)的蛋白量高于同一時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、正常早產(chǎn)兔在生后72小時(shí)內(nèi)隨著生后日齡的增長(zhǎng)，腦部GLUT1蛋白量是減少的，而GLUT3蛋白量是增多的。
　　2、早產(chǎn)兔發(fā)生重度GM-IVH后，腦組織GLUT1表達(dá)量的上調(diào)，代表一種代償反應(yīng)，之后的降低導(dǎo)致了腦脊液糖濃度的降低。
　　3、早產(chǎn)兔發(fā)生重度GM-IVH后，腦組織GLUT3蛋白量有暫時(shí)性的增多，是