1、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)的開放讀碼框2(Open reading frame2,ORF2)編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白—衣殼蛋白,是病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合的關(guān)鍵部分,可能決定著HEV感染。HEV主要有4個(gè)基因型,1型和2型僅感染人,3型和4型既感染人也感染豬等動(dòng)物。3型和4型被認(rèn)為是人畜共患病毒,豬是HEV的動(dòng)物宿主。HEV感染和宿主限制性的分子機(jī)制尚不清楚。本課題旨在篩選、驗(yàn)證與HEV ORF2相互作用的蛋白并

2、分析1型和4型ORF2與豬蛋白相互作用的差異,探索宿主蛋白在 HEV感染過程中的作用,為研究 HEV的感染及跨種屬傳播機(jī)制提供線索。
　　為了研究HEV感染人的機(jī)制,本研究篩選、驗(yàn)證人肝臟文庫中與ORF2相互作用的蛋白。首先,通過分裂-泛素酵母雙雜交系統(tǒng),以HEV4型ORF2(aa112-660)為誘餌蛋白,對(duì)人肝臟cDNA文庫進(jìn)行了三次篩選。通過酵母共轉(zhuǎn)染進(jìn)行驗(yàn)證,獲得了43種可能與ORF2相互作用的蛋白。其次,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期

3、利用1型ORF2篩選人肝臟cDNA文庫獲得的蛋白,發(fā)現(xiàn)在人肝臟文庫中有21種蛋白均與1型和4型ORF2相互作用。分析蛋白質(zhì)的性質(zhì)、定位、功能后,挑選出15種蛋白采用pull-down進(jìn)一步驗(yàn)證與ORF2的結(jié)合,確定了8種與ORF2相互作用的蛋白,分別為ASGR2、BNIP3、C14orf1、EBP、HMOX2、TMEM134、TMEM14A和TMEM230。最后,采用經(jīng)典免疫共沉淀技術(shù)(co-immunoprecipitation,Co

4、-IP),進(jìn)一步驗(yàn)證了ORF2與TMEM134的結(jié)合作用。
　　同時(shí),為了研究 HEV種屬限制性的機(jī)制,本研究分析了不同基因型 ORF2與不同種屬宿主蛋白的相互作用:(1)對(duì)前期實(shí)驗(yàn)在豬肝臟文庫中篩選到的僅與4型ORF2結(jié)合的蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證,運(yùn)用pull-down技術(shù)比較其與1型、4型ORF2相互作用的差異,發(fā)現(xiàn)NNT、MTCH2、STX12和SEC62B4種蛋白均與1型、4型ORF2作用,只有ATL2蛋白與不同基因型ORF2的相

5、互作用存在差異。(2)通過克隆人ATL2基因,比較了人ATL2與1型和4型ORF2作用的差異,發(fā)現(xiàn)人、豬ATL2均與4型ORF2作用,而與1型ORF2不作用。ATL2與不同基因型ORF2作用的差異可能與HEV的宿主范圍相關(guān)。(3)對(duì)ASGR2候選蛋白進(jìn)行了研究,通過克隆豬、鼠ASGR2基因,比較不同種屬ASGR2與ORF2作用的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1型、4型ORF2均與人、豬ASGR2作用。
　　總之,本研究篩選出可能與HEV感染相關(guān)的