1、本探究分為三部分：
　　 第一部分：Tc17細(xì)胞亞群在ITP中的表達(dá)及機(jī)制研究
　　 原發(fā)性免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)是臨床最為常見的出血性疾病，約占出血性疾病總數(shù)的30％。ITP臨床表現(xiàn)為皮膚粘膜出血，月經(jīng)過多，內(nèi)臟出血，甚至顱內(nèi)出血，嚴(yán)重影響人類健康。ITP是血小板破壞過多和（或）生成不足共同導(dǎo)致的血小板計(jì)數(shù)減少。細(xì)胞免疫反應(yīng)異常的機(jī)制包括抗原遞呈細(xì)胞

2、、T細(xì)胞和B細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用。如Th1/Th2細(xì)胞亞群失衡，血小板特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量的減少或抑制功能受損，以及細(xì)胞毒性T細(xì)胞對血小板的破壞等。T細(xì)胞異常被認(rèn)為在ITP發(fā)生中起著重要作用。但是，血小板減少癥細(xì)胞免疫異常的具體機(jī)制尚不明確。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，在健康成年個體內(nèi)，可發(fā)現(xiàn)具有潛在自身反應(yīng)活性的T細(xì)胞。許多報(bào)道涉及細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，如Th1細(xì)胞異常，抑制性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例降低，及細(xì)胞

3、毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的血小板破壞，同時，有研究報(bào)道細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的血小板減少性紫癜動物模型。
　　 Th17是新發(fā)現(xiàn)的輔助性T細(xì)胞亞群，特異性產(chǎn)生IL-17。IL-17被證明在包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)，和過敏原特異性反應(yīng)在內(nèi)的自身免疫性疾病中起關(guān)鍵作用。在我們前期研究中，利用流式細(xì)胞術(shù)通過細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子分析，檢測了ITP患者和正常對照者外周血Th17水平，首次證明了Th17細(xì)胞比例在ITP患者外周血中

4、升高。
　　 T-bet是新發(fā)現(xiàn)的T-box家族轉(zhuǎn)錄因子，選擇性地在Th1細(xì)胞中表達(dá)。作為Th1細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，并在Th1細(xì)胞的分化中起著決定性作用。有研究發(fā)現(xiàn)，缺乏T-bet表達(dá)的CD8+T細(xì)胞向產(chǎn)生IL-17分流。據(jù)觀察，小鼠體內(nèi)分泌IL-17的CD8+T細(xì)胞存在T-bet缺失，并在移植排斥中發(fā)揮作用。最近，一個分泌IL-17的新的CD8+T效應(yīng)細(xì)胞，Tc17細(xì)胞亞群受到關(guān)注。一項(xiàng)研究表明，Tc1

5、7細(xì)胞可能是一個不同于分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞(TCl)的亞群。
　　 Tc17細(xì)胞參與了諸如感染，腫瘤，自身免疫性疾病等多種疾病，Tc17細(xì)胞分泌的IL-17，腫瘤壞死因子(TNF)，和IFN-γ在增強(qiáng)招募T細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中起到重要作用。然而，與Th17不同的是，Tc17細(xì)胞亞群只收到少數(shù)關(guān)注。而且，Tc17的特點(diǎn)和ITP患者Th17與Tc17之間的關(guān)系還沒有得到系統(tǒng)的研究。
　　 為了進(jìn)一步研究Tc

6、17細(xì)胞在ITP的發(fā)病機(jī)制中的作用，我們檢測了Tc17細(xì)胞水平并于Th17細(xì)胞水平相比較，以評價(jià)其臨床相關(guān)性。
　　 目的：
　　 檢測ITP患者體內(nèi)Tc17水平，分析Tc17與Th17相關(guān)性，并利用地塞米松體外干預(yù)ITP患者外周單個核細(xì)胞，檢測Tc17表達(dá)變化。通過檢測Tc17在ITP外周血中的水平，及地塞米松對其的影響，研究Tc17在ITP中的作用。
　　 方法：
　　 ◆選擇初診ITP患者46例，正

7、常對照來自于34例健康志愿者。
　　 ◆流式細(xì)胞術(shù)檢測Tc17和Th17細(xì)胞在CD3+T細(xì)胞中所占比例。
　　 ◆提取ITP患者單個核細(xì)胞加入地塞米松培養(yǎng)3天，檢測培養(yǎng)后的PBMCs中Tc17細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的比例。
　　 ◆利用改良的MAIPA技術(shù)檢測特異性血小板抗體GPⅡ b/Ⅲa和GPⅠ b/Ⅸ.水平。
　　 結(jié)果：
　　 ◆ITP患者T細(xì)胞中IL-17的表達(dá)
　　 與正常對照組

8、相比，Tc17細(xì)胞比例在ITP患者T細(xì)胞中顯著升高(0.79±0.69％ vs0.39±0.33％, P＜0.001)。
　　 同時驗(yàn)證ITP患者和正常對照組Th17細(xì)胞有顯著差異(2.10±.33％ vs1.40±0.90％，P＜0.01)。
　　 ◆Tc17和Th17的相關(guān)性
　　 在正常對照外周血中，Tc17和Th17呈正相關(guān)(r=0.7239，P＜0.0001)，而在ITP患者外周血中，無相關(guān)性(r=-0

9、.0817，P=0.590)。
　　 ◆ITP患者外周血中，Tc17與CD8/CD4比值及CD8+T細(xì)胞的相關(guān)性
　　 與正常對照組（2.10±0.82）相比較，CD8/CD4比值在ITP患者中下降(1.47±0.91;P=0.029)，同時和正常對照組相比較，CD8+細(xì)胞百分比(23.99±5.92％)在ITP患者中升高(30.97±12.19％，P=0.025)。
　　 Tc17和CD8/CD4比值呈正相關(guān)(

10、P=0.001)，Tc17和CD8+T細(xì)胞呈正相關(guān)(P=0.006)。
　　 ◆在自身抗體陰性的ITP患者外周血中，Tc17有升高趨勢
　　 和MAIPA陽性的ITP患者外周血Tc17(0.57±0.25％)相比較，MAIPA陰性ITP患者的Tc17水平有升高趨勢(1.15±1.09％，P=0.07)。
　　 ◆地塞米松對ITP患者PBMCs中Tc17細(xì)胞的百分比的影響
　　 隨著培養(yǎng)液中地塞米松濃度的增

11、加，ITP患者PBMCs中Tc17細(xì)胞的百分比降低。
　　 結(jié)論：
　　 ◆ITP患者外周血中的Tc17比例升高。
　　 ◆正常人外周血中，Tc17細(xì)胞與Th17細(xì)胞成正比;而ITP患者外周血中，這兩種細(xì)胞亞群比例紊亂。
　　 ◆地塞米松抑制ITP患者PBMCs中Tc17的比例。
　　 意義：
　　 ITP患者Tc17細(xì)胞亞群表達(dá)升高，細(xì)胞免疫異常是ITP重要發(fā)病機(jī)制之一。DXM可能提高I

12、TP患者Tc17的比例。Tc17細(xì)胞亞群可能在ITP發(fā)病中起重要作用，提示阻斷IL-17有希望為ITP的治療提供新思路。
　　 第二部分：Th22細(xì)胞亞群在ITP中的表達(dá)及機(jī)制研究
　　 原發(fā)性免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia, ITP)是由于機(jī)體免疫失耐受,產(chǎn)生的抗血小板自身抗體與血小板表面特異性抗原結(jié)合,導(dǎo)致血小板在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)過度破壞引起血小板減少。此外,多種細(xì)胞免

13、疫機(jī)制異常,如Thl極化、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)目降低或者抑制功能缺陷、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)介導(dǎo)的血小板破壞等在ITP的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。到目前為止,出現(xiàn)上述異常的具體原因尚未明確。
　　 隨著近幾年來細(xì)胞免疫研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)了一些新的輔助性T細(xì)胞亞群。如Th17細(xì)胞亞群、Th9細(xì)胞亞群等,通過各種途徑在自身免疫性疾病和變應(yīng)性炎癥中發(fā)揮作用。
　　 Th22細(xì)胞的生物學(xué)特

14、性通過用二醋酸羧基熒光素(CFSE)標(biāo)記外周T細(xì)胞、邊緣區(qū)的朗格漢斯細(xì)胞(LCs)和樹突狀細(xì)胞(DCs),流式細(xì)胞技術(shù)分析T細(xì)胞的增殖發(fā)現(xiàn),LCs能夠誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-22, DCs作用稍弱于朗格漢斯細(xì)胞,但同樣可以誘導(dǎo)IL-22產(chǎn)生,表明的LCs與DCs都可以誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞向Th22細(xì)胞亞群分化。在這個過程中,幾乎沒有IL-17產(chǎn)生。并且,Th22細(xì)胞的分化可能部分依賴于IL-6和TNF-α的調(diào)節(jié)作用。Th22細(xì)

15、胞是了一種穩(wěn)定成熟的T細(xì)胞亞群,記憶性的Th22細(xì)胞不會向其他亞群分化。
　　 目前,Th22細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制還不完全明確。Th22細(xì)胞的調(diào)節(jié)性與T細(xì)胞的調(diào)節(jié)相似。其主要分泌IL-22細(xì)胞因子,IL-1β和TNF-γ能夠加強(qiáng)IL-22受體分子表達(dá)途徑,特別是IL-22R1和STAT-3途徑。當(dāng)機(jī)體感染病毒或細(xì)菌等病原體后,Th22細(xì)胞能和Th17細(xì)胞在一些自身免疫性疾病的發(fā)病中發(fā)揮作用。
　　 STAT3是信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激

16、活因子(Signal Transducer and Activator of Transcription, STAT)蛋白家族成員。STAT家族是一組可以被不同的細(xì)胞因子受體激活的相關(guān)蛋白,在細(xì)胞因子-受體相互作用的過程中充當(dāng)載體,保持信號在細(xì)胞內(nèi)傳遞的內(nèi)在特異性。Th17細(xì)胞的分化也依賴STAT-3和RORC的活化,并受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié),包括IL-6, IL-1β,轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)和IL-23A,以及自分泌產(chǎn)生的IL

17、-21。
　　 IL-22是Th22細(xì)胞分泌的效應(yīng)細(xì)胞因子,在多種細(xì)胞中誘導(dǎo)STAT信號通路的活化。以往研究發(fā)現(xiàn),STAT-1, STAT-3和STAT-5可被IL-22快速強(qiáng)烈的激活。后來的研究表明,其表面受體結(jié)合IL-22的大鼠肝癌H4IIE細(xì)胞株可快速誘導(dǎo)激活JAK1和TYK2,并繼而導(dǎo)致STAT-1, STAT-3和STAT-5的磷酸化。IL-22參與了多種人類某些自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制,如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA),克羅

18、恩病等。迄今還沒有研究報(bào)告的數(shù)據(jù)顯示Th22細(xì)胞亞群(CD4+IFN-γ-IL-17-IL-22+T細(xì)胞)和Th17細(xì)胞亞群在ITP患者中的情況。
　　 為了研究Th22細(xì)胞亞群在ITP患者發(fā)病機(jī)制中的作用,我們檢測了Th22細(xì)胞,Th17細(xì)胞,Th1細(xì)胞,血漿IL-22水平和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子STAT-3和RORC mRNA的相對定量表達(dá)。并分析了它們在ITP中的相互關(guān)系。
　　 目的：
　　 檢測ITP患者外周血T

19、h22細(xì)胞亞群和血漿IL-22水平,分析Th22與Th17、Th1相關(guān)性,并檢測外周血單個核細(xì)胞STAT-3、RORC mRNA的相對定量表達(dá),研究Th22細(xì)胞亞群在ITP中的作用。
　　 方法：
　　 ◆選擇初診ITP患者44例,正常對照來自于36例健康志愿者。
　　 ◆利用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th22、Th17和Th1細(xì)胞在PBMCs中所占比例。
　　 ◆酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked imm

20、unoadsorbent assay, ELISA)檢測血漿中IL-22細(xì)胞因子水平。
　　 ◆實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測相關(guān)STAT-3和RORC mRNA水平。
　　 結(jié)果：
　　 ◆ITP患者外周血中Th22細(xì)胞亞群的百分比
　　 與正常對照組(0.73％；0.24-1.56%)相比,Th22細(xì)胞比例在ITP患者外周血中顯著升高(1.19%；0.1-9.51%,P<0.0001)。
　　 ◆IT

21、P患者血漿中IL-22細(xì)胞因子的水平
　　 與正常對照組(9.98±1.06pg/ml)相比,Th22細(xì)胞比例在ITP患者外周血中顯著升高(13.39±8.33pg/ml; P<0.0001)。
　　 ◆Th22細(xì)胞亞群和IL-22細(xì)胞因子的相關(guān)性
　　 在ITP患者外周血中,Th22細(xì)胞亞群和IL-22細(xì)胞因子呈正相關(guān)(r=0.8457,P<0.001,),而在正常對照組中,二者無相關(guān)性(r=0.2253,P=

22、0.3014)。
　　 ◆ITP患者外周血中,Th22與Th17和Thl細(xì)胞的相關(guān)性
　　 Th22與Th17細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.7678,P<0.0001),Th22和Thl細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.6056,P=0.0047),Th17和Thl也呈正相關(guān)(r=0.5344,P=0.0126)。
　　 ◆STAT-3和RORC mRNA在ITP患者外周血中的表達(dá)升高
　　 STAT-3mRNA在ITP患者

23、中的相對定量表達(dá)(1.644；1.164-2.189)比正常對照組(1.584；1.057-1.776；P<0.05)明顯升高。
　　 RORC mRNA在ITP患者中的相對定量表達(dá)(2.502；1.885-2.846)比正常對照組(2.208；1.381-2.886；P<0.05)明顯升高。
　　 ◆在自身抗體陰性的ITP患者外周血中,Th22細(xì)胞顯著升高
　　 和MAIPA陽性的ITP患者外周血Th22(0.

24、83；0.23-1.24)相比較,MAIPA實(shí)驗(yàn)陰性ITP患者的Th22水平有升高趨勢(2.35; range,0.39-9.51;P=0.013).
　　 ◆Th22細(xì)胞亞群與ITP臨床指標(biāo)無明顯相關(guān)性
　　 Th22細(xì)胞亞群百分比和患者外周血血小板計(jì)數(shù)無顯著相關(guān)性(r=-0.0849,P=0.493)。
　　 結(jié)論：
　　 ◆ITP患者外周血中的Th22細(xì)胞百分比升高。
　　 ◆ITP患者血漿

25、中IL-22細(xì)胞因子濃度升高,且與Th22細(xì)胞呈正相關(guān)。
　　 ◆轉(zhuǎn)錄因子STAT-3和RORC mRNA在ITP患者外周血中的表達(dá)升高。
　　 意義：ITP患者Th22細(xì)胞亞群和血漿IL-22濃度都明顯升高,在mRNA水平,相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子顯著升高,提示Th22參與的細(xì)胞免疫異?？赡苁荌TP重要發(fā)病機(jī)制之一。針對Th22細(xì)胞亞群的相關(guān)措施有希望為ITP的治療提供新思路。
　　 第三部分：中和IL-17A和IL-21

26、通過Th17信號傳導(dǎo)通路緩解免疫性血小板減少癥患者Th17/Treg細(xì)胞免疫異常的研究
　　 多種細(xì)胞免疫機(jī)制異常,如Thl極化、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)目降低或者抑制功能缺陷、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)介導(dǎo)的血小板破壞等在ITP的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。到目前為止,出現(xiàn)上述異常的原因尚未明確。
　　 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,其在細(xì)胞核表達(dá)Foxp3,為功能性免疫抑制性T細(xì)胞亞群,并在誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受

27、中發(fā)揮關(guān)鍵作用。許多自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,I型糖尿病和多發(fā)性硬化癥與外周血Treg不足有關(guān)。許多研究表明,活動性ITP患者Treg細(xì)胞缺陷,而導(dǎo)致ITP患者自身免疫耐受功能缺陷。我們以前的研究中也觀察到ITP患者的Treg細(xì)胞功能和數(shù)量的異常。
　　 Th17細(xì)胞的特點(diǎn)是在人體產(chǎn)生IL-17A (IL-17), IL-17F, IL-21, IL-22和IL-26。IL-21的自分泌,激活STAT3,誘導(dǎo)RORyT是調(diào)

28、節(jié)Th17細(xì)胞系分化的關(guān)鍵點(diǎn)。Th17細(xì)胞及其效應(yīng)細(xì)胞因子越來越被認(rèn)為在炎癥,自身免疫性疾病和過敏反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。Th17細(xì)胞已被證明在誘導(dǎo)包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE),和過敏原特異性反應(yīng)在內(nèi)的自身免疫性疾病中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。在我們的前期工作中,我們通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子進(jìn)行分析,首次證明了Th17細(xì)胞在ITP患者外周血中升高。由于Th17和Treg細(xì)胞異常參與了ITP的發(fā)展過程,通過有效阻斷

29、細(xì)胞因子將會是調(diào)節(jié)Th17/Treg失衡并治療ITP的新策略。
　　 Th17通路細(xì)胞因子[白介素17A (IL-17A)和白介素21(IL-21)]在我們的前期研究中已被證實(shí)在免疫性血小板減少癥患者(ITP)外周血中高表達(dá),IL-21與Th17亞群上調(diào)呈正相關(guān),提示IL-17A和IL-21可能在ITP中發(fā)揮作用。然而,IL-17A和IL-21在ITP中的作用尚不明確。
　　 目的：
　　 為了進(jìn)一步研究他們在I

30、TP發(fā)病中的作用,我們用IL-17A, IL-21及其抗體干預(yù)并觀察它們對增殖、凋亡、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的作用。檢測干預(yù)后ITP患者和正常對照組單個核細(xì)胞STAT1, STAT3, STAT5,和RORC表達(dá),尋求IL-17A和IL-21細(xì)胞因子在ITP患者外周血中的作用及機(jī)制。
　　 方法：
　　 ◆用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離25個ITP患者及21個健康人外周血單個核細(xì)胞(PBMCs),同時用

31、免疫磁珠分選29個ITP患者及20個健康人的外周血CD3+T細(xì)胞。
　　 ◆PBMCs或CD3+T細(xì)胞分四個實(shí)驗(yàn)組(分別用IL-17A, IL-21, IL-17A抗體,IL-21抗體干預(yù))和1個對照組。PBMCs各組同時用IL-2維持細(xì)胞分化生長,CD3+T細(xì)胞各組同時用CD3/CD28單克隆抗體維持,都在37-C,5%C02條件下孵育72小時。
　　 ◆用CCK8法檢測細(xì)胞增殖。
　　 ◆用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞

32、凋亡率、Th17及Treg細(xì)胞比例。
　　 ◆應(yīng)用ELISA測定IL-17A (IL-17A抗體)組上清培養(yǎng)液中的IL-21和IL-21(IL-21抗體)組上清培養(yǎng)液中IL-17A的濃度。
　　 ◆利用實(shí)時定量-聚合酶鏈反應(yīng)(QT-PCR)測定RORC, STAT-1, STAT-3and STAT-5mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 ◆ITP患者標(biāo)本經(jīng)IL-17A或IL-21干預(yù)培養(yǎng)后：
　　

33、 a. Th17百分比升高(2.09±2.18%或1.70±1.20%vs1.57±1.53%)；
　　 b. Treg百分比降低(5.69±3.01%或5.69±2.09%vs6.19±2.76%)；
　　 c. 凋亡率降低(5.24±4.39%或5.05±4.59%vs6.48±5.59%)。
　　 ◆經(jīng)IL-17A抗體或IL-21抗體干預(yù)后：
　　 a. Th17百分比降低(1.21±1.27%o

34、r1.38±1.18%vs1.57±1.53%)；
　　 b. Treg百分比升高(6.82±3.00%or6.67±3.01%vs6.19±2.76%)；
　　 c. 凋亡率升高(6.67±5.39%or6.78±4.90%vs6.48±5.59%)。
　　 ◆而在健康人中未發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。
　　 ◆在ITP患者和健康人中,各組增殖率未見顯著性差異(P>0.05)。
　　 ◆有趣的是,CD3+T細(xì)

35、胞在CD3/CD28單克隆抗體(或IL-2)及干預(yù)因子條件下經(jīng)過72小時培養(yǎng)后,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測不到Th17細(xì)胞亞群。
　　 ◆與其他研究不同的是,我們意外發(fā)現(xiàn)ITP患者PBMCs或CD3+T細(xì)胞中的Treg亞群分別經(jīng)IL-2(6.25±3.39%vs5.884±2.05%)或CD3/CD28單克隆抗體(6.08±1.15%vs5.944±1.97%)體外培養(yǎng)72小時后,其百分比與健康人組相比未見顯著性差異。
　　 ◆

36、IL-21干預(yù)組升高ITP患者IL-17A細(xì)胞因子的濃度。
　　 ◆與正常對照相比,在ITP患者PBMCs中,IL-17A升高STAT1, STAT3,而沒有升高RORC or STAT-5,同時IL-21促進(jìn)STAT-1, STAT-3, STAT-5, RORC mRNA的轉(zhuǎn)錄。
　　 ◆IL-17A單克隆抗體降低RORC, STAT-1轉(zhuǎn)錄,同時上調(diào)STAT-3和STAT-5,同時IL-21單克隆抗體上調(diào)RORC,

37、 STAT-3,下調(diào)STAT-1mRNA的轉(zhuǎn)錄。
　　 結(jié)論：
　　 ◆中和Th17通路細(xì)胞因子下調(diào)Th17亞群,上調(diào)Treg亞群和T細(xì)胞凋亡率,提示Th17通路細(xì)胞因子在ITP的免疫異常的發(fā)病機(jī)制中起著一定作用。
　　 ◆該研究還提示,體外Th17的正常分化需要PBMCs中除CD3+T細(xì)胞之外其他細(xì)胞的存在。
　　 ◆較之健康對照組,IL-2在ITP患者PBMCs中有更明顯的升高Treg的作用。