1、目的：動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是絕大多數(shù)心腦血管疾病的重要病理基礎，纖維蛋白溶解系統(tǒng)在防止血栓形成，保證血流通暢方面有重要作用。內(nèi)皮細胞分泌的組織型纖溶酶原激活物（tissue—type plasminogen activator，t—PA）和纖溶酶原激活物抑制劑—1（type—1 plasminogen activator inhibitor，PAI—1）是纖溶系統(tǒng)外源性激活途徑中最重要的兩種活性物質(zhì)，二者

2、之間的平衡是體內(nèi)纖溶功能的決定因素。蛋氨酸的代謝產(chǎn)物同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）作為AS的獨立危險因素已經(jīng)得到證實，Hcy損傷內(nèi)皮細胞纖溶功能是引起AS的主要機制之一。茶多酚（tea polyphenols，TP）是從茶葉中提取的一類多羥基酚類化合物的總稱，TP對AS的防護作用已受到廣泛關(guān)注，但其機制尚未完全明了，尤其是關(guān)于TP能否通過保護內(nèi)皮細胞纖溶功能來防治AS的研究甚少。本實驗將通過高蛋氨酸飲食和Hcy分別誘導

3、大鼠和人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）纖溶功能損傷，觀察給予TP后t—PA和PAI—1蛋白水平和mRNA水平的變化，旨在從體內(nèi)和體外實驗綜合探討TP對血管內(nèi)皮的保護作用和對纖溶功能的影響，通過翔實的實驗數(shù)據(jù)為TP抗AS提供進一步的理論依據(jù)。 方法： 1．TP對體外培養(yǎng)的HUVEC纖溶功能的保護作用 1．1 細胞培養(yǎng) 將凍存的HUVE

4、C復蘇后，37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。 1．2 四唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法篩選TP和Hcy濃度 將處于對數(shù)生長期的HUVEC分為TP組和Hcy組，各組分別加入不同濃度的TP和Hcy，使TP終濃度分別為12．5、25、50、100、200μg/ml，Hcy終濃度分別為0．5、1、2、4mmol/L，同時各組分別設溶劑對照組和不接種細胞的空白對照，培養(yǎng)24

5、h后采用MTT法測定細胞增殖率。 1．3 10μg/ml TP對t—PA、PAI—1含量及mRNA水平的影響 將處于對數(shù)生長期的HUVEC分為4組：Hcy組：加入終濃度為0．5 mmol/L的Hcy； TP組：加入終濃度為10μg/ml的TP； Hcy+TP組：加入終濃度為0．5mmol/L的Hcy與10μg/ml的TP；對照組：加入等體積溶劑。各組培養(yǎng)24 h后鏡下觀察細胞形態(tài)學改變，ELISA法測定細胞上清液中的t—

6、PA和PAI—1含量，RT—PCR法檢測細胞t—PA和PAI—1 mRNA水平。 1．4 不同給予方式，不同濃度TP對t—PA、PAI—1含量的影響 1．4．1 同時給予TP和Hcy組：將處于對數(shù)生長期的細胞按下列分組同時給予不同處理因素：Hcy組、2μg/ml TP+Hcy組、4μg/ml TP+Hcy組、8μg/ml TP+Hcy組、16μg/ml TP+Hcy組、對照組。各組Hcy終濃度均為0．5 mmol/L，對

7、照組加入等體積溶劑，ELISA法測定細胞上清液中的t—PA和PAI—1含量。 1．4．2 先給予Hcy組：按上述方法接種細胞并分組后，各組先給予終濃度為0．5mmol/L的Hcy作用12 h，換液，Hcy組與正常對照組加入等體積溶劑，其余四組分別給予2、4、8、16μg/ml TP，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，ELISA法測定細胞上清液中的t—PA和PAI—1含量。 2．TP對大鼠纖溶功能的保護作用研究 2．1 動物分組

8、 健康Wistar雄性大鼠（200±20g）50只隨機分為對照組、模型組、TP低、中、高劑量組共5組，每組10只，適應性喂養(yǎng)1周后，模型組及TP組均喂飼含3%蛋氨酸的飼料，同時各TP組每天經(jīng)灌胃分別給予50 mg/kg·bw TP、100mg/kg·bw TP和200 mg/kg·bw TP，灌胃量為0．5 ml/100g·bw；對照組喂飼正?；A飼料，對照組和模型組同時經(jīng)灌胃給予等容量的蒸餾水。大鼠喂養(yǎng)8周后禁食12 h斷頭處死

9、。 2．2 指標測定 ELISA法測定大鼠血漿t—PA和PAI—1含量；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT—PCR）檢測大鼠主動脈t—PA和PAI—1mRNA水平的變化；蘇木素—伊紅（HE）染色觀察主動脈弓病理變化；SABC免疫組織化學法測定大鼠主動脈弓t—PA和PAI—1蛋白表達；試劑盒測定大鼠血清丙二醛（malondialdehyd

10、e，MDA）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH—Px）活性、一氧化氮（nitric oxide，NO）含量以及一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性；全自動生化儀測定大鼠血清甘油三酯（triglyceride，TG）和總膽固醇（totalcholesterol，TC）含量。 結(jié)論： 1．Hcy和TP濃度分別達到1 mmol/L、200μg/ml即

11、對體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞產(chǎn)生毒性作用。 2．Hcy能誘導內(nèi)皮細胞形態(tài)改變和纖溶功能紊亂，TP通過調(diào)節(jié)PAI—1的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平，維持PAI—1和t—PA的平衡狀態(tài)，預防并修復內(nèi)皮細胞的纖溶功能。 3．高蛋氨酸飲食誘導大鼠血管平滑肌細胞移行增生和內(nèi)皮纖溶功能紊亂，TP能夠抑制平滑肌增生，并通過調(diào)節(jié)t—PA和PAI—1的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平維持PAI—1和t—PA的平衡狀態(tài)，從而修復纖溶功能，防止AS的發(fā)生發(fā)展。 4．TP可降