1、蛇根木(Rauvolfia serpentina Benth.ex Kurz)為夾竹桃科蘿芙木屬藥用植物，富含生物堿類化合物，其主要活性成分為阿嗎靈、阿嗎堿和利血平等。其有退熱、抗癲、消炎及治蟲蛇咬傷等功效，現用于治療高血壓及心律失常。對其次生代謝產物生物合成途徑關鍵酶的研究是進一步開發(fā)利用該藥用植物、調控生物代謝方向、體外生物-化學合成活性化合物的基礎。
　　本論文對蛇根木生物堿阿嗎靈生物合成支鏈途徑中催化蘿卡辛水解形成蘿芙木樂

2、寧的蘿卡辛糖苷酶(Raucaffricine Glucosidase，RG，EC3.2.1.125)進行了一系列的研究，主要涉及RG的異源表達、純化、酶學表征、結晶、三維結構表征、催化機制及底物特異性機制和RG抑制劑的研究。同時，本論文對室溫（RT）與冷凍條件下收集到的X-射線衍射數據進行了比較。
　　以pQE-2質粒為表達載體，在大腸桿菌M15中異源高效表達N端帶有(His)6標簽的RG并利用Ni-NTA親和層析進行純化。酶動力

3、學考察表明RG對底物蘿卡辛的Km值為0.78 mM，對底物異胡豆苷的Km值為1.7 mM。為進一步探明RG三維結構，活性中心及各配體的結合情況，本論文通過懸滴蒸發(fā)結晶法獲得RG及無活性突變體RG-E186Q的晶體，并通過底物浸泡的方式制備其與配體復合物。本文共處理得到8套RG的結構模型:其中RG，RG-glycerol，RG-glucose，RG-inhibitor結構由冷凍條件下收集的衍射數據處理得到;RG-E186Q，RG-E186

4、Q-dihydroraucaffricine, RG-E186Q-secologanin, RG-E186Q-glucose結構由室溫條件下收集的衍射數據處理得到。
　　RG及其無活性突變體的整體三維結構呈典型的（β/α）8桶狀結構，與同處于阿嗎靈生物合成途徑上游的異胡豆苷糖苷酶(SG)一致。通過結果比較，揭示兩種酶底物特異性差異的機制:RG的活性空腔入口較寬，SG的天然底物異胡豆苷也可以進入到RG的活性中心;而SG狹長的活性空腔

5、入口阻礙蘿卡辛進入SG的活性中心。RG-Trp392與SG-Trp388影響了兩酶活性空腔入口的形狀，從而控制酶的底物接受能力。RG-Ser390直接影響著RG-Trp392側鏈構象，間接調控底物接受能力。定點突變及活性數據進一步證實了結構分析的結果，深化對糖苷酶的底物特異性及催化機制的認識。
　　隨后，本文考察了4種deoxypyranosylamine類抑制劑對RG的抑制情況，4種抑制劑的抑制效果差異較大，抑制劑常數Ki跨度從

6、0.06到620μM。其中RG與抑制劑N-(cyclohexylmethyl)-β-D-gluco-1，5-deoxypyranosylamine復合物的三維結構已成功解析。三維結構顯示，該抑制劑專一地結合于RG的活性位點，占據RG的底物結合部位，為競爭性抑制機制提供了結構依據。通過比較各抑制劑的抑制活性數據，并結合抑制劑復合物的結構信息，揭示抑制劑的糖苷模擬以及非糖苷模擬部分對抑制效果均有顯著影響。
　　最后，本文通過比較冷凍與