1、蛇根木(Rauvolfia serpentina Benth.ex Kurz)為夾竹桃科蘿芙木屬藥用植物,富含生物堿類化合物,其主要活性成分為阿嗎靈、阿嗎堿和利血平,有降血壓、抗心律失常、退熱、抗癲、治蟲蛇咬傷等功效。對其次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑的研究是進一步開發(fā)利用該藥用植物、調(diào)控生物代謝方向、體外異源表達活性成分的基礎。本論文對參與蛇根木生物堿阿嗎靈生物合成途徑的聚精液素醛酯酶(PNAE) Vinorine合成酶(VS)和異胡豆苷合

2、成酶(STR1)進行了一系列的研究,主要包括酶的表達、純化、結晶、三維結構表征及催化機理研究。為進一步深入研究PNAE酶的三維結構,活性位點構造及催化機理,本論文對PNAE酶的突變體及突變體與底物的復合物進行了結晶條件的摸索,采用氣相擴散懸滴法進行結晶,底物浸泡法獲取PNAE突變體與產(chǎn)物的復合物,對所搜集衍射數(shù)據(jù)進行分析處理,獲得了酶與產(chǎn)物的三維結構,闡明了該酶與底物的結合位點及其催化機理,為合理進行結構改造提供了結構基礎。VS酶的三維

3、結構已經(jīng)闡明,但其活性位點及催化機理尚不確定,因此對VS酶與底物或輔因子復合物三維結構的解析顯得尤為重要。本論文嘗試了各種獲得復合物的方法,并搜集了衍射數(shù)據(jù),經(jīng)初步處理并未發(fā)現(xiàn)配體出現(xiàn)在酶分子中。由于STR1高效表達過程中產(chǎn)生大量的包涵體,獲得的可溶性蛋白量很低,為進一步利用該酶帶來了很大的不便。本論文對原有表達系統(tǒng)進行了改進并構建了新的表達系統(tǒng),對不同的表達系統(tǒng)進行了表達量篩選及活性比較,確定改進的表達系統(tǒng)的表達量為原有表達系統(tǒng)表達量