1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過體外分離并培養(yǎng)大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stemcells，BMSCs)，對(duì)其進(jìn)行鑒定后并應(yīng)用超順磁性氧化鐵(superparamagnetic ironoxid，SPIO)對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，并通過Feeney's法建立大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic braininjury，TBI)模型，然后將SPIO標(biāo)記的BMSCs移植到TBI模型大鼠腦組織內(nèi)，并聯(lián)合應(yīng)用重組人促紅細(xì)胞生成素（re

2、combinant human erythropoietin，rhEPO），從大鼠的行為學(xué)、影像學(xué)及組織學(xué)方面綜合評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)情況，并探討兩者聯(lián)合應(yīng)用的神經(jīng)保護(hù)的作用及其機(jī)制，為臨床應(yīng)用rhEPO聯(lián)合BMSCs治療TBI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、采用全骨髓貼壁篩選法分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs，培養(yǎng)過程中在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)鑒定細(xì)胞的表面抗原CD29、CD34、CD45和C

3、D90。將培養(yǎng)的第3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2、采用一定濃度的SPIO標(biāo)記培養(yǎng)的第3代BMSCs，運(yùn)用普魯士藍(lán)染色檢測(cè)其標(biāo)記率，并檢測(cè)細(xì)胞在標(biāo)記前后活力變化。
　　3、取120只SD雄性大鼠，采用Feeney's法建立大鼠TBI模型，隨機(jī)分為4組，每組30只。A組:對(duì)照組，TBI模型建立后不給予任何治療;B組:TBI模型建立后給予腹腔注射rhEPO治療;C組:TBI模型大鼠給予SPIO標(biāo)記的BMSCs腦內(nèi)移植;D組:TBI

4、模型大鼠給予SPIO標(biāo)記的BMSCs腦內(nèi)移植及聯(lián)合注射rhEPO治療。
　　4、各組實(shí)驗(yàn)大鼠在細(xì)胞移植后第1d、3d、7d、14d和28d采用改良的神經(jīng)功能缺損法(NSS)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)價(jià)BMSCs移植及應(yīng)用rhEPO的療效。
　　5、采用干濕法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)損傷周圍腦組織的含水量。
　　6、分別于TBI模型建立后24h、細(xì)胞移植后28d，對(duì)大鼠腦組織進(jìn)行蘇木精-伊紅染色以觀察損傷腦組織的病理改變及恢復(fù)情況。

5、r>　　7、于各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行顱腦MRI檢查，動(dòng)態(tài)觀察標(biāo)記的BMSCs的分布及遷移，最后于移植后第28d每組取2只大鼠處死后行腦組織普魯士藍(lán)染色，驗(yàn)證標(biāo)記細(xì)胞在腦內(nèi)的存活及遷移情況。
　　結(jié)果：
　　1、通過全骨髓貼壁篩選法培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，可見部分細(xì)胞開始貼壁，多呈圓球形和梭形;當(dāng)培養(yǎng)至第7d時(shí)，細(xì)胞呈集落樣貼壁生長(zhǎng)，集落逐漸擴(kuò)大，相鄰細(xì)胞間相互融合，排列緊密，細(xì)胞胞體增大，多呈梭形。細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)傳代后，細(xì)胞呈梭形成纖維樣

6、生長(zhǎng)，形態(tài)單一，分布均勻。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，第3代的BMSCs表面CD29、CD90表達(dá)陽(yáng)性，而CD34、CD45表達(dá)陰性。
　　2、Fe濃度為25ug/ml的SPIO標(biāo)記BMSCs后48h，經(jīng)細(xì)胞涂片行普魯士藍(lán)染色，倒置顯微鏡下觀察見所有標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)均可看到藍(lán)色的鐵顆粒，顆粒在細(xì)胞質(zhì)中，呈簇狀或散在分布，細(xì)胞標(biāo)記率為100％。標(biāo)記SPIO和未標(biāo)記SPIO的BMSCs的活細(xì)胞比率分別為98.5％、99％，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞

7、0.05)。
　　3、各組大鼠在細(xì)胞移植術(shù)后隨著時(shí)間延長(zhǎng)NSS評(píng)分不斷降低，不同時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); rhEPO治療組、BMSCs治療組、rhEPO+BMSCs治療組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)評(píng)分明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); rhEPO+BMSCs治療組在不同時(shí)間點(diǎn)評(píng)分明顯低于rhEPO治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);rhEPO+BMSCs治療組在移植后第7d、14d、28d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)分明

8、顯低于BMSCs治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、腦組織含水量測(cè)定結(jié)果顯示:大鼠顱腦損傷后第3d腦組織含水量最高。移植后第7d各組腦組織含水量較第3d明顯降低，存在顯著性差異(P＜0.05);第14d時(shí)各組腦組織含水量與第7d相比降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);第7d、14d時(shí)rhEPO治療組、BMSCs治療組、rhEPO+BMSCs治療組腦組織含水量與對(duì)照組相比，含水量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

9、，rhEPO+BMSCs治療組與rhEPO治療組、BMSCs治療組相比，腦組織含水量降低更明顯，差異存在顯著性意義(P＜0.05)。
　　5、HE染色結(jié)果顯示:腦組織損傷后24h可見到腦組織斷裂，結(jié)構(gòu)紊亂，形成較多的空洞，伴有神經(jīng)纖維疏松，胞體皺縮，間質(zhì)水腫明顯，部分神經(jīng)細(xì)胞變性壞死。腦組織損傷后28d時(shí)對(duì)照組、BMSCs治療組和rhEPO+BMSCs治療組均可見損傷區(qū)域可見梗死灶，神經(jīng)細(xì)胞胞體皺縮，胞漿濃縮紅染，胞核固縮、溶解，

10、神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，神經(jīng)細(xì)胞明顯較少。部分腦組織斷裂，有瘢痕連接，組織結(jié)構(gòu)紊亂。rhEPO+BMSCs治療組與另外兩組相比，神經(jīng)細(xì)胞變性壞死的數(shù)目明顯變少，間質(zhì)水腫也較輕。
　　6、MRI顯示移植后第1d、3d可見移植部位為團(tuán)塊狀類圓形低信號(hào)影，邊界光滑清晰，損傷部位表現(xiàn)局部小面積的梗死。細(xì)胞移植后第7d，BMSCs治療組和 rhEPO+BMSCs治療組都可見移植部位的低信號(hào)影較前擴(kuò)大，邊界略顯模糊;損傷腦組織局部高信號(hào)影擴(kuò)大，甚至

11、遠(yuǎn)離損傷部位也顯示高信號(hào)，rhEPO+BMSCs治療組與BMSCs治療組相比，局部高信號(hào)影略少。細(xì)胞移植后第14d，可見沿胼胝體腹側(cè)走形的線性低信號(hào)影，與移植部位相連，BMSCs治療組線性低信號(hào)影長(zhǎng)度較rhEPO+BMSCs治療組短，rhEPO+BMSCs治療組梗死病灶皮層下可見線性的低信號(hào)影;兩組損傷部位高信號(hào)影都較第7d時(shí)較少;細(xì)胞移植后第28d，可見移植細(xì)胞遷移所致的沿胼胝體腹側(cè)走形的線性低信號(hào)影向病損部位延伸，rhEPO+BMS

12、Cs治療組可見低信號(hào)影向著梗死灶扇形分布，甚至跨越中線遷移至對(duì)側(cè)缺血異常高信號(hào)區(qū)域邊緣。
　　7、細(xì)胞移植后第28d大鼠腦組織切片普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示SPIO標(biāo)記的BMSCs沿著胼胝體遷移形成細(xì)胞遷移流，呈條帶狀，其遷移形狀與MRI結(jié)果相符。
　　結(jié)論：
　　1、采用全骨髓培養(yǎng)貼壁法可以較為簡(jiǎn)便而有效地獲取均質(zhì)性良好的大鼠BMSCs;細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、表面標(biāo)志物表達(dá)方面具有干細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　2、SPIO在適當(dāng)

13、的標(biāo)記濃度、標(biāo)記時(shí)間時(shí)可以簡(jiǎn)便有效地標(biāo)記大鼠BMSCs，且不影響干細(xì)胞的生物學(xué)活性。
　　3、采取將BMSCs移植到TBI大鼠腦組織內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用rhEPO，大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯下降，大鼠的運(yùn)動(dòng)功能、感覺功能等明顯改善，損傷腦組織含水量明顯降低，有效的降低腦組織水腫及改善神經(jīng)功能。
　　4、將標(biāo)記有SPIO的BMSCs移植入大鼠腦內(nèi)，通過MR成像可以活體動(dòng)態(tài)觀察BMSCs在腦內(nèi)的遷移及分布情況，觀察到BMSCs可以向損傷腦