1、中華蜜蜂apes cerana cerana(簡稱中蜂)為原產(chǎn)我國的本土蜜蜂，具有較西方蜜蜂Apis mellifera L(簡稱西蜂)更敏銳的嗅覺，如具有善于利用零星蜜源的能力，通常氣味結(jié)合蛋白OBPs直接參與了嗅覺感器識別感知外界氣味分子的過程；另外中蜂有著敏銳準確的鑒別能力和強烈的排異性，及作為原始寄主對雅氏瓦螨Varroa jacobsoni的適應抗性，化學感受蛋白CSPs可能直接參與了中蜂的這種排異行為以及抗螨過程。

2、本論文通過構(gòu)建cDNA文庫并結(jié)合批量ESTs測序，對中蜂頭部功能基因進行了分析。在此基礎(chǔ)上，著重通過對中蜂主要的觸角特異蛋白——Ac-ASP1，Ac-ASP2(氣味結(jié)合蛋白OBPs)和Ac-ASP3(化學感受蛋白CSPs)進行基因克隆，并通過其在觸角中的轉(zhuǎn)錄表達譜和在觸角不同感器內(nèi)的亞細胞定位，以期對上述分子進行鑒定，最終對揭示中蜂靈敏的嗅覺以及獨特的排異和抗螨能力奠定重要的基礎(chǔ)。具體的研究結(jié)果如下： 1．構(gòu)建了包含十三個日齡的

3、中蜂頭部cDNA文庫。通過LD-PCR技術(shù)有效地合成出全長ds-cDNA和組織中低豐度的mRNA，電泳結(jié)果顯示，合成的ds-cDNA在0.6～1.0kb之間有數(shù)條可見的條帶，顯示為高豐度的基因。對未擴增文庫和擴增文庫分別采用PCR擴增和藍白斑鑒定的方法證明構(gòu)建文庫的重組率較高(重組率分別達到90％和97.6％)，且?guī)烊莞?未擴增文庫的滴度達到1.25×10<'6>pfu/ml，擴增文庫的滴度約為1.74×10<'9>pfu/ml)。

4、 2．基于構(gòu)建好的中蜂cDNA文庫，利用批量化ESTs測序策略，成功得到了質(zhì)量較好的有效ESTs序列862條，經(jīng)拼接后分別得到“Contig”和“Singleton”序列68個和184個。將拼接后的序列進行注釋，ESTs庫中存在相當數(shù)量的高豐度基因，如王漿蛋白1(major royaljelly protein 1，MRJP1)，王漿蛋白2(major royalielly protein 2，MRJP2)，葡萄糖氧化酶(gluco

5、se oxidase，GOX)和王漿多肽(Apisimin)等，以及與觸角信息傳遞相關(guān)蛋白如氣味結(jié)合蛋白OBPl5等多種功能基因，為以后的研究提供了基礎(chǔ)。 3．根據(jù)西方蜜蜂的研究，我們從中蜂觸角中首次克隆TAc-ASP1，Ac-ASP2與Ac-ASP3等三個主要的觸角特異蛋白基因序列ORF全長，GenBank登錄號分別為DQ449670、DQ449667與DQ449669。序列分析可知Ac-ASP1，Ac-ASP2均具有6個保守

6、的半胱氨酸，而Ac-ASP3具有4個保守的半胱氨酸。通過多序列聯(lián)配、系統(tǒng)發(fā)育樹及序列相似性分析，Ac-ASP除與西方蜜蜂Am-ASP親緣關(guān)系較近(相似性達到80％以上)外，與其它膜翅目以及鞘翅目的OBPs及CSPs也有一定的親緣關(guān)系(相似性達到30～60％)，且Ac-ASP1和Ac-ASP2應為OBPs，Ac-ASP3則應為CSPs。 4．利用Real-time PCR技術(shù)，分析了Ac-ASP1，Ac-ASP2與Ac-ASP3基

7、因的時空表達情況，結(jié)果表明該三個基因的表達模式為：Ac-ASP1高豐度地表達于工蜂觸角，而在其它器官(如頭、胸、腹、翅及足)中呈低豐度表達；Ac-ASP2特異地表達于工蜂觸角，在其它器官中均不表達；Ac-ASP3除在觸角中表達外在其它器官中也表達，但表達豐度不均一。在各發(fā)育歷期中，Ac-ASP1在幼蟲、蛹期到6日齡以及21日齡前后具有兩個表達高峰，二者表達豐度相當；Ac-ASP2在幼蟲及蛹中均不表達，在成蟲中具有幾個豐度較高的日齡，即1

8、、9、15、27、30日齡，這兩個高表達時期均要較其它時期高出近十倍以上：Ac-ASP3在從蛹期到6日齡以及18日齡前后具有兩個表達高峰，其中前者的平均表達豐度約為后者的兩倍。 5．對中蜂主要的觸角特異蛋白基因序列中的普通氣味結(jié)合蛋白Ac-ASP2和化學感受蛋白Ac-ASP3進行了原核表達，其中Ac-ASP2為包涵體表達，而Ac-ASP3為可溶性表達。二者分別通過梯度尿素洗滌和鎳NTA瓊脂糖凝膠親和層析純化，每升LB培養(yǎng)基分別可

9、以得到50mg和15mg的抗原量。從純化效果看，Ac-ASP3純度要Ac-ASP2高，但是后者的得率要比前者高。二者均作為免疫抗原制備了多抗血清，經(jīng)雙向免疫擴散試驗測定效價，Ac-ASP2和Ac-ASP3的抗血清效價分別達到1∶32和1∶64，特異性好且效價高，完全符合免疫探針制備要求。 6．制備了Ac-ASP2和Ac-ASP3相應的膠體金探針。利用免疫電鏡對中蜂Ac-ASP2和Ac-ASP3在觸角感器中進行亞細胞定位鑒定，其中

10、Ac-ASP2表達于板形感器(sensilla placodea，sp)、毛形感器A(sensilla trichoidea A，stA)等嗅覺感器，表明Ac-ASP2參與中蜂觸角嗅覺識別機制；Ac-ASP3則主要表達于錐形感器(sensilla basiconica，sb)和毛形感器B(sensilla trichoidea B，stB)等機械感器內(nèi)，表明Ac-ASP3可能參與中蜂觸角的機械運動。對于最終揭示兩者在中蜂嗅覺系統(tǒng)及化學感