1、昆蟲的蛻皮和變態(tài)是昆蟲發(fā)育生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。昆蟲的角質(zhì)層主要由表皮蛋白和幾丁質(zhì)組成;幾丁質(zhì)由N-乙酰葡萄糖胺聚合而成，結(jié)構(gòu)明確，而表皮蛋白的結(jié)構(gòu)和特征具有多樣性，昆蟲角質(zhì)層的性質(zhì)主要由其中的表皮蛋白性質(zhì)所決定。表皮蛋白和表皮蛋白基因被認(rèn)為是研究昆蟲蛻皮與變態(tài)調(diào)控機(jī)理的重要模型，受到越來越多的重視。目前關(guān)于表皮蛋白家族基因的研究多數(shù)集中在果蠅、家蠶等物種，蜜蜂中這類基因的相關(guān)研究很少。中華蜜蜂是我國(guó)特有的優(yōu)良土著蜂種，對(duì)維護(hù)植物資源物

2、種的多樣性，促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。研究表皮蛋白家族基因功能可以為深入闡明分析中華蜜蜂的蛻皮發(fā)育機(jī)制，豐富中華蜜蜂資源保護(hù)理論提供科學(xué)依據(jù)。
　　本研究以中華蜜蜂(Apis cerana cerana)為材料，利用同源序列，通過RT-PCR和RACE-PCR的方法克隆得到中華蜜蜂兩個(gè)表皮蛋白新基因，分別命名為AccCPR1和AccCPR2并對(duì)它們進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、表達(dá)特性分析和功能預(yù)測(cè)。本研究的具體結(jié)果如下:

3、>　　(1)從中華蜜蜂中分離得到首個(gè)R&R亞族的表皮蛋白基因，命名為AccCPR1，Genbank登陸號(hào)為JQ282798。其cDNA全長(zhǎng)為822 nt，包括573 nt的開放閱讀框，編碼一個(gè)190個(gè)氨基酸殘基的多肽，預(yù)測(cè)的分子量和等電點(diǎn)分別為21.3 kDa和6.50。生物信息學(xué)分析表明，多肽鏈中包含一個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域，屬于典型的R&R-2型表皮蛋白;在幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域β-折疊頻繁發(fā)生(42.5％)，而在其他的區(qū)域一個(gè)β-折疊也沒有;A

4、ccCPR1與同屬于膜翅目的CPRs比屬于雙翅目或半翅目的CPRs在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上更親密。R&R保守基序中最保守的序列:G-x8-G-x6-Y/F，幾乎在所有的表皮蛋白(CPRs)保持不變，但AccCPR1及其直系同源物對(duì)于最保守的R&R基序的組成序列(G-x8-G-x6-Y/F)是個(gè)例外。在其啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)5個(gè)E74和4個(gè)BR-C轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)AccCPR1可能參與蜜蜂的蛻皮與變態(tài)。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蜜蜂

5、體內(nèi)蛻皮激素的濃度到達(dá)高峰開始下降時(shí)AccCPR1啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，這說明AccCPR1的轉(zhuǎn)錄需要一個(gè)蛻皮激素的“脈沖”機(jī)制。我們采用不同的試驗(yàn)方法驗(yàn)證了這個(gè)假設(shè)。20E是蛻皮激素的主要成分，當(dāng)給幼蟲飼喂含有不同濃度的20E時(shí)，高濃度的蛻皮激素抑制了AccCPR1的表達(dá)。將白蛹期的胸部表皮在含有不同濃度的20E的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)高濃度的蛻皮激素抑制AccCPR1的表達(dá)，除去20E可以恢復(fù)表達(dá)。組織特異性表達(dá)與免疫組織化學(xué)定位表明AccCPR1

6、在表皮與中腸表達(dá)。這些結(jié)果表明，AccCPR1是一種典型的R&R-2型表皮蛋白，在蜜蜂的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，并且蛻皮激素的“脈沖”機(jī)制對(duì)AccCPR1的表達(dá)非常重要。
　　(2)從中華蜜蜂中分離得到第二個(gè)R&R亞族的表皮蛋白基因，并命名為AccCPR2，Genbank登陸號(hào)為KJ502287。其cDNA全長(zhǎng)為1134 nt，編碼一個(gè)234個(gè)氨基酸殘基的多肽，預(yù)測(cè)的分子量為26.3 kDa，預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)為6.69。多肽鏈中包含一個(gè)幾

7、丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域，R&R保守基序中最保守的序列:G-x8-G-x6-Y/F，可以在AccCPR2及其直系同源物的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域發(fā)現(xiàn)。AccCPR2基因組的第一個(gè)內(nèi)含子在編碼5個(gè)氨基酸之后中斷信號(hào)肽，而這是昆蟲表皮蛋白家族基因組序列的一個(gè)典型特征;在5'端空白區(qū)域發(fā)現(xiàn)了若干個(gè)假定的與發(fā)育有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括3個(gè)假定的BR-C結(jié)合位點(diǎn)、5個(gè)假定的CdxA結(jié)合位點(diǎn)、1個(gè)假定的HB結(jié)合位點(diǎn)和3個(gè)假定的DFD結(jié)合位點(diǎn)，說明AccCPR2可能參

8、與蜜蜂的蛻皮與變態(tài)。
　　生物信息學(xué)分析表明AccCPR2也屬于與幾丁質(zhì)結(jié)合的R&R-2類型表皮蛋白，但是其表達(dá)方式與以往在有些昆蟲上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的“脈沖”機(jī)制有比較大的差異。不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性分析表明，在蛹期AccCPR2的表達(dá)量隨著蛻皮激素濃度的升高而增加，說明AccCPR2的轉(zhuǎn)錄需要蛻皮激素持續(xù)存在。將預(yù)蛹期的表皮在含有不同濃度的20E的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)隨著20E濃度的升高，AccCPR2表達(dá)量增加，并進(jìn)一步確定了20E誘

9、導(dǎo)表皮蛋白表達(dá)需要的時(shí)間。將剛出房的成年幼蜂暴露于各種應(yīng)激條件中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AccCPR2mRNA的表達(dá)水平在重金屬(HgCl2，CdCl2)處理后上升，而在殺蟲劑（溴氰菊酯，百草枯）處理后先上升后下降。AccCPR2基因的抗逆性直接證據(jù)來自重組蛋白的活性分析，盡管重金屬和殺蟲劑處理間基因表達(dá)的模式有所不同，但是菌落擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果是相似的。異源表達(dá)結(jié)果表明，AccCPR2可能參與抗逆性應(yīng)激反應(yīng)。
　　本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AccCPR1和